一种微生物检测试剂盒及检测方法与流程
本发明涉及微生物检测，尤其涉及一种微生物检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
1、微生物污染是影响食品安全性、饮用水卫生、临床诊疗准确性及环境质量的关键因素，快速、准确检测微生物种类及含量，是预防微生物传播、控制污染风险的核心手段。目前，微生物检测的常规方法主要包括传统培养法、生化鉴定法及普通核酸扩增法，这些方法在实际应用中存在诸多局限，难以满足高效、精准的检测需求。
2、传统培养法作为微生物检测的经典方法，依据微生物的生长特性进行分离培养与鉴定，存在检测周期长的致命缺陷，无法实现污染的快速预警，尤其不适用于急诊临床、食品快速放行等时效敏感场景。同时，该方法操作繁琐，需经过接种、培养、生化反应等多步手工操作，人工成本高，且对不可培养或生长缓慢的微生物检出率极低，易出现漏检情况。生化鉴定法通过检测微生物的代谢产物实现种类区分，虽能在一定程度上缩短检测时间，但仍依赖前期培养过程，且检测特异性较差，易受样本中杂质干扰，对于形态相似、代谢产物相近的微生物难以准确区分，假阳性率较高。此外，该方法检测通量低，单次仅能检测单一或少数几种微生物，无法满足多病原同步检测的需求，与临床端、工业端对高效检测的需求存在明显错配。现有核酸扩增类检测试剂盒，虽解决了传统方法检测周期长的问题，但仍存在灵敏度不足、抗干扰能力弱、制备工艺复杂等问题。多数试剂盒采用常规引物探针设计，对低浓度微生物的检出能力有限；同时，样本前处理过程繁琐，需额外添加裂解试剂，且试剂盒内组分稳定性差，在常温下易失效，需低温冷藏运输和储存，增加了检测成本和操作难度。此外，现有技术多针对单一菌种设计，缺乏对复杂样本中目标微生物的特异性识别能力，易受杂菌干扰。
3、为了解决上述问题，发明专利文献cn119846208b公开了一种微生物检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括包被捕获抗体的酶标板、hrp标记抗体工作液；所述捕获抗体为特异性结合人贾第鞭毛虫抗原的单克隆抗体lg3a-1，其重链氨基酸序列如seq idno.1所示，轻链氨基酸序列如seq id no.2所示；所述hrp标记抗体为特异性结合人贾第鞭毛虫抗原的单克隆抗体flsp4，其重链氨基酸序列如seqid no.3所示，轻链氨基酸序列如seq id no.4所示。该发明提供的微生物检测试剂盒能够检测人粪便中贾第鞭毛虫的含量，特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简单，具有很好的应用前景。然而，其检测范围单一，仅能针对人粪便中的贾第鞭毛虫进行检测，无法实现多种常见病原微生物的同步检测，且未解决低浓度微生物检测漏检及检测效率偏低的行业痛点，难以适配食品、饮用水、环境样品等多场景的检测需求。
4、因此，开发一种兼具高灵敏度、短周期与强特异性的微生物检测试剂盒及检测方法具有非常重要的现实意义和产业价值。
技术实现思路
1、本发明有鉴于上述情况，目的为提供一种微生物检测试剂盒及检测方法，该试剂盒制备工艺简单、组分稳定、抗干扰能力强，检测方法快速、精准、操作便捷，能够实现多种微生物的同步检测。
2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种微生物检测试剂盒，包括微生物核酸提取液、pcr反应液、阳性对照品、阴性对照品、终止液及检测缓冲液；
3、优选的，所述微生物核酸提取液每100ml由以下原料组成：异硫氰酸胍15-20g、1mol/l ph=8.0的tris-hcl缓冲液18-22ml、edta-na2 0.5-0.8g、triton x-100 1-1.5ml、10mg/ml的rnase a 98-102μl、甜菜碱0.3-0.5g、l-半胱氨酸0.05-0.1g、抗坏血酸0.1-0.15g，余量为无酶去离子水；
4、优选的，所述pcr反应液每25μl由以下原料组成：2×taq pcr mastermix 12-13μl、10μmol/l的大肠杆菌特异性引物对各0.4-0.6μl、10μmol/l的金黄色葡萄球菌特异性引物对各0.4-0.6μl、10μmol/l的沙门氏菌特异性引物对各0.4-0.6μl、10μmol/l的白色念珠菌特异性引物对各0.4-0.6μl、sybr green i荧光染料0.2-0.4μl，余量为无酶去离子水；
5、优选的，所述大肠杆菌特异性引物对的上游引物序列为5’-ggtgatgctggtgctgataa-3’，下游引物序列为5’-ctgctggtggtggtggtgat-3’；所述金黄色葡萄球菌特异性引物对的上游引物序列为5’-agaagcgttatccggaatga-3’，下游引物序列为5’-cagcggtttgtccttgtaac-3’；所述沙门氏菌特异性引物对的上游引物序列为5’-atgaagaaagcgaaagcgga-3’，下游引物序列为5’-tcgctgcgttcttcatcagt-3’；所述白色念珠菌特异性引物对的上游引物序列为5’-gagagtttgatcctggctcag-3’，下游引物序列为5’-tgcaccatctgtcactctgtta-3’；
6、优选的，所述阳性对照品为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、白色念珠菌的标准核酸溶液，浓度均为100ng/μl，所述大肠杆菌菌株为大肠杆菌k-12 mg1655，金黄色葡萄球菌菌株为金黄色葡萄球菌atcc 25923，沙门氏菌菌株为鼠伤寒沙门氏菌atcc14028，白色念珠菌菌株为白色念珠菌atcc 90028；
7、优选的，所述阴性对照品为无酶去离子水；所述终止液为0.4-0.6mol/l的edta-na2溶液，ph=8.0；所述检测缓冲液每100ml由以下原料组成：1mol/l ph=7.5的tris-hcl缓冲液25-35ml、nacl 5-6g、mgcl2 0.25-0.35g，余量为无酶去离子水。
8、优选的，所述微生物核酸提取液每100ml中还包括如下原料：吐温-20 0.1-0.2ml、牛血清白蛋白0.2-0.4g、聚乙二醇peg 6000 0.1-0.3g、np-40 0.08-0.15ml、d-山梨醇0.2-0.3g。
9、本发明的另一个目的，在于提供一种采用上述微生物检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
10、步骤s1、样本前处理：分别对食品、饮用水、医疗样本、环境样品进行对应预处理，获得备用样本液；
11、步骤s2、微生物核酸提取：取备用样本液1ml，加入0.8-1.2ml微生物核酸提取液，室温放置9-12min，11000-13000r/min离心10-12min，吸取上清液并加入1ml检测缓冲液混匀，备用；
12、步骤s3、pcr扩增：取含20-24μl pcr反应液的反应管，分别加入2-4μl核酸溶液、阳性对照品、阴性对照品，混匀离心后，放入实时荧光定量pcr仪进行pcr扩增；
13、步骤s4、结果判断：阴性对照品无扩增曲线且ct值＞38，阳性对照品有明显扩增曲线且ct值＜38、溶解曲线单一无杂峰，样本ct值≤38且溶解曲线与对应阳性对照品一致则为阳性，否则为阴性；检测结束后加入终止液终止反应。
14、优选的，步骤s3中所述pcr扩增的扩增程序为：预变性95℃ 5min；变性95℃ 30s，退火58℃ 30s，延伸72℃ 30s，共40个循环；溶解曲线分析95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。
15、优选的，步骤s1中所述预处理具体为：当样本为食品时，取25g样本加入225ml0.9%无菌生理盐水，均质2min获得1:10匀液，梯度稀释后取1ml备用；当样本为饮用水时，取10ml样本8000r/min离心10min，弃上清液，用1ml无菌生理盐水重悬沉淀备用；当样本为医疗痰液时，加入等体积无菌生理盐水振荡混匀，8000r/min离心10min，弃上清液重悬沉淀；医疗血液样本：取1ml加入3ml红细胞裂解液振荡10min，8000r/min离心10min，弃上清液重悬沉淀；当样本为环境土壤时，取10g加入90ml无菌生理盐水，振荡30min静置10min，取1ml上清液备用；当样本为环境污水时，取10ml 8000r/min离心10min，弃上清液重悬沉淀备用。
16、由于上述技术方案的运用，本发明具有以下有益效果：
17、（1）本发明公开的微生物检测试剂盒及检测方法，通过各组分的科学配比与协同作用，突破了现有技术的诸多局限，取得了积极技术增益，相较于传统检测方法及现有核酸扩增类试剂盒，在检测效率、灵敏度、特异性及适配性上实现了显著提升。其中，微生物核酸提取液中各原料并非简单叠加，而是形成了协同增效的技术体系：异硫氰酸胍作为核心裂解成分，可高效破坏微生物细胞壁结构，甜菜碱与之协同作用，不仅能进一步增强裂解效果，还能有效保护核酸不发生变性，避免核酸降解导致的检测失效；l-半胱氨酸与抗坏血酸形成抗氧化协同体系，可清除样本裂解过程中产生的活性氧自由基，减少核酸链损伤，同时辅助提升细胞壁裂解效率，与异硫氰酸胍、甜菜碱配合，使核酸提取纯度和回收率明显提升，解决了现有试剂盒核酸提取纯度低、回收率不足的技术痛点。
18、（2）本发明公开的微生物检测试剂盒及检测方法，通过优化pcr反应液的组分配比及引物设计，实现了四种常见病原微生物的同步精准检测，打破了现有技术单一菌种检测的局限，同时显著提升了检测灵敏度与特异性，有效解决了低浓度微生物检测漏检、杂菌干扰导致假阳性的行业难题。其中，四种特异性引物对经序列比对无交叉杂交现象，可特异性扩增对应微生物核酸，结合sybr green i荧光染料的精准示踪作用，与2×taq pcrmastermix协同，进一步缩短了扩增时间，使整个检测流程短，相较于传统培养法（24-72h）、现有核酸检测试剂盒（120min以上），检测效率大幅提升，适配急诊临床、食品快速放行等时效敏感场景。
19、（3）本发明公开的微生物检测试剂盒及检测方法，微生物核酸提取液中新增的吐温-20、牛血清白蛋白、聚乙二醇peg 6000、np-40、d-山梨醇等组分，与原有组分形成多维度协同作用，进一步优化了试剂盒的综合性能：吐温-20与triton x-100协同提升去污能力，减少样本中杂质对核酸的吸附；牛血清白蛋白可与提取液中的蛋白酶结合，抑制蛋白酶对核酸的降解，同时稳定rnase a的活性，避免酶失活影响rna杂质去除效果；聚乙二醇peg6000可促进核酸沉淀，进一步提升核酸回收率；d-山梨醇维持提取体系渗透压稳定，保护微生物细胞裂解过程中核酸不被破坏，这些组分的协同作用，使核酸提取的完整性、稳定性显著提升，同时延长了试剂盒的保存期限，解决了现有试剂盒组分稳定性差、需严格低温储存运输、使用成本高的问题。
20、（4）本发明公开的微生物检测试剂盒及检测方法，操作便捷，无需复杂的前处理设备，样本前处理流程经过优化，针对食品、饮用水、医疗样本、环境样品等不同类型样本设计了针对性预处理方案，既保证了样本中目标微生物的充分富集，又简化了操作步骤，降低了人工成本，相较于现有技术中繁琐的样本前处理流程，大幅提升了操作便捷性，同时避免了因操作繁琐导致的检测误差。无需专业的高端设备，可适配食品卫生监督、临床检验、环境监测等多场景检测需求，解决了现有试剂盒制备复杂、检测场景受限的问题，具有显著的产业价值和应用前景。