与玉米矮秆性状紧密连锁的InDel分子标记、检测试剂及其应用

本发明涉及分子遗传学，具体涉及一种与玉米矮秆性状紧密连锁的indel分子标记、检测试剂及其应用。

背景技术：

1、玉米是重要的粮食、饲料及工业原料作物，其产量和稳定性直接关系到农业生产效益。随着玉米种植密度不断提高，植株过高、茎秆机械强度不足所导致的倒伏问题日益突出。矮秆或适度降低株高有利于改善玉米群体结构，提高植株抗倒伏能力，增强高密度种植条件下的耐密性，并有助于实现机械化收获。因此，矮秆性状已成为玉米株型改良和高产育种中的重要目标性状之一。

2、通过对不同玉米矮秆材料的研究分析表明，玉米的株高受单基因以及多基因两套独立遗传体系的调控。单基因体系的矮化植株是由个别位点的主效基因控制，只要含有一个矮化基因，株高就会显著降低。多基因体系的矮化植株是由多个微效基因累加作用决定的，累加的越多，株高越矮。迄今为止，已经通过研究鉴定了60多个具有降低株高效应的矮秆位点，成功定位的矮秆基因有30多个，例如

d1、

d3、

d8、

d9、

br2、

kn1、

zmacs7、

zmte1等。然而多数携带矮秆基因的植株常伴随不良农艺性状（如生物量减少或抗逆性减弱等），严重限制了其在育种实践中的应用潜力。目前可以应用于育种的矮秆资源较少，遗传基础狭窄，所以进一步挖掘、利用新的矮秆资源具有重要意义。

3、对于新发现的玉米矮秆突变材料，由于其控制矮秆性状的基因位置及连锁变异尚不明确，通常缺乏能够准确区分矮秆基因型与正常基因型的分子标记，限制了矮秆基因在种质鉴定、遗传分析、回交转育及分子标记辅助育种中的应用。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种与玉米矮秆性状紧密连锁的indel分子标记、检测试剂及其应用。利用本发明的indel分子标记可以检测鉴定玉米矮秆性状，可简便、快捷、高通量的用于育种实践，加速了玉米的育种进程。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种与玉米矮秆性状紧密连锁的indel分子标记，所述indel分子标记命名为indel-jz24，位于玉米3号染色体22,856,489bp-22,856,490bp之间，参考基因组为b73 refgen_v5；

4、在具有矮秆性状的玉米材料中，3号染色体22,856,489bp-22,856,490bp之间存在一个长片段的插入，所述长片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。具体如下：

5、tggatacggatacgggtacttttatttccgggacggatacgggtattacccggatagaatcttatcggatacgggacggatacgggacgtgcaatacccggtaaatacccgacatcctcgggcggatacgggtacccggctcccgggtacccggtaatctttctggcccaatagctagccggcccaatccacctaaaagctgaaggctccaggaaccgacgctgggtcgctggtctacggcctaaccttgggtccctggcggcctggcccttgccgcttgcctccagtcaccagcacagcacagcacgccgcgccgccaggtcgccagtaccaggccccagcccccagccgcgtgaggcgccgcgccgccgccagaggccagaccgagcggcgagccggtgagcgcccgtccgtccgcgaccgcgtccgcccgagcggacctgtacaagcagccaagcagtaagcacctcaccgagcactcgagcagcgtccatcggcctcaccgagcgcagatctccctcaccgagcgctccatcgcccatcggcctcatcacctcttctccagcgaccagcggcctcgagcagcgtccggcgcgtccgcccgtgcagcgtccaccgtctaggccggtgtccaccgttcaggccgtccgtccgagcagcgtcctccctcgcccgagcagctaattcaccgagcagcgtcctccctcgcccgagcagcgtccaccgtccaggccgtccgtccgaggctcccagcgaccaagattcagtctactgctccaggcgccgccatcgtcgcaccgacccctgcctccagctctaggcgccgtcgacccctgcatccaagaatgcagcagccccacaccggcgtatcaggccccaacagcgggcactcctcggcggccaccatcgttggctcgtcgtcggcggctcgtcagcagcagcaagacgcacctgacggccgaaccctcgatccgtggccccgtcgtgcagcccctcacccttggtaatgttgttgacgatgacataccacttagtatgatttaccaactattagtaactttgctcatataatgacagcgccatggatgtcgatgatatttgtggcattgacaacaatgtgtcccatgaagatgaaatacatgataccggggaggatgttaatgctaacaacagtgaacgtcctgagcctattggtagtaaggtgaatgtcctgagccaacaagttagtcgtggaaaaaacaagtctgtcgatgaagaccatcgtgcagtgaaacgacaactaacaaccaagtcaaccaataccccaacaagcaagtttatggcagcttcatttaaagcagcaaggtcacaccagagcatggatttagtgccacaattagctaaaggtgtcctatttgactttatttgtttcattttcatgtgactataaacgtatattaacatgtgtccctttttactttatttgttttgttatagttgcacaagatggaagtgtgagcgcaaatgaaaatgcaagcgtagctgcaagtgtccaaataagcactgaagatgaattggatgaagaacaagtcaagaaaaagaagctcacttcatgggtttgggagcatttcacaaggtatgatgtagaagtggagcaaactgatggttccattgttaagcaaaaatgggcaaaatgcaaaaaatgtgcacataaagctaaggctgatagttcaaatggcacaaaggcttttagtaaccatttaaagctgaggcataagattttgaagggtcaacaacacctaactcagaatggcgatactatatcaacatataaatatgatgagaattttagtgtgagactgctatattatgccatcatcatgcatgagtatcctttcagtattatccaacacaagtacttgatgaaatttatcaaatcactgcgaccatcatttcctttgaagtcacgtgtcactgctcgtaaagagatcatggatctttatattgaggaaaagaatatgttgtatgcacaattcaaaaagttgtcctgtcgtgttagtttcactatggatacatggacatctattcagaacaagtcatatttgtgtgtcactgcacattggattgatgataattggaacatgcaaaaaaggattattaattttatgcatgtagaaggcaaccatagtgggataaaattgagtgatgctttttttgctaatgtgttgaattggaaccttgataagaaaatgtttgctctttctttggataatgctgcttcaaacaaggttgctgttgatatagtgattgacaatgctaaagacttgcttgtctgtggaggaaagttctttcatgttagatgtgccaatcatatattgaaccttgttgctagagatgggttagctgtaattgcacatgccattggaaacattagacattttataacaattattaaaaggtcacccctgcagttggaggcatttgagaaatgtgcaagagaatgtgacctagaccctaaaaaatctctttccttggatgttgcaacaagatggaattccacatatattatggttagagatgccatttactataagaatgcttttgatcgccttgcaaaaaaagaaaaggatagatatggtcatatcaatccttcagctaatgattggttgaatgcattaaacattagcaaatgtttgaagaagttttatgatgtcacattacttttttctggcacttcatatcctactgcaaatcatttctttcgtaaattctctgagataaagatggctattgcaagatggtgtgatagtagcgatcccataatctgcaccatggcatattctatgagagacaagtttgataagtattgggaaatgaacaatatggctttggcagtgggagcatttcttgatcctaggtacaaacatagaatggttgagctgtacatgtctaagatgtatgatagtgagatggctgatttggagaaaatggcattcatgaatgttattaatgaattattttcttgctattcatcaaccatcaatgcaaaatcaaccaaaaaagggactagctcgaaggattttgttccaaataaacaagttttgatggctgatgatgatgagaatgaggttgatcttgatgagttgtatgcagcaacagacaatgagaagaaagtgtcagaattggatctatacatgagtgagggcctagtgaaggctaatgaaagtgatgcaccatttaatgccttatcatggtggaagggtcaagtgacaaatttccctattctttctacccttgctcgtgatgtactatcaatgcaggtgtcaactgttgcttcagagtcggcatttagctctggtggacgcgtggttgatgcctttcgttcgaagcttaaacctgaaattattgaagccttggtttgtactaaggattggaagattgcttcagagaaaggtttcattttattgtgcatgtgttcttgtatttctctatgactaaatgatgatgatggttattgatatgttttgttgttctctattggtttcagatttggagtgtgaaataaaaactatagctgaagctatgaatgctatggaggtggacgatgatgttgcgacttgagatcttcaaacaagcatggattgcttgcactattttatgccatttgaaaactaccttttattgtaatagtctattgtgttgaactatcttgtgctatgttagactcttgtgtgatgtgaacttatcgctattatatttgaactattgtgttagactattgtatgctatgaacttattgttatattgtcttgttgatctatggtctatgtaatgctatattgtatgatgtgttgaatgatgagaacttactgctatattatcatgttggactattgtgttgtatgatgtgaacttattgctatattgtcatgttagaatattacattccatgatgtaaacttattgttatattgtcatgatggactattatgttgcacgatgtaattaatttatgcaccaactgaattatagtgaatgataatcaatgtatgcattatccgataagtacccggtacgcccgactaaatacccggtccctgtatccgtatccgtcccgtttctaactatccgtatccgatcccgtatccgattgaaatacattagggtaggatacgggatgacctactatccgtccgtatccgcccgttttcaccccta。

6、本发明的分子标记indel-jz24与玉米矮秆性状紧密连锁，利用本发明的分子标记indel-jz24可以对具有矮秆性状的玉米材料进行鉴定，对于玉米育种和种质资源筛选具有重要意义。

7、本发明的第二方面，提供上述indel分子标记在筛选或鉴定具有矮秆性状的玉米材料中的应用。

8、本发明的第三方面，提供一种检测试剂，所述检测试剂包含：用于扩增上述indel分子标记的引物对，所述引物对由seq id no.2所示的上游引物f1、seq id no.3所示的上游引物f2和seq id no.4所示的下游引物r组成；具体如下：

9、上游引物f1：5’-tctggcatcttgatgtgccttgctggaa-3’；（seq id no.2）

10、上游引物f2：5’-tggacgatgatgttgcgact-3’；（seq id no.3）

11、下游引物r：5’-ggcctcactagcgggtgaaactaactga-3’。（seq id no.4）

12、进一步的，所述检测试剂中还包括：dna模板、taq master mix和ddh2o。

13、本发明的第四方面，提供上述检测试剂在如下（1）或（2）中的应用：

14、（1）筛选或鉴定具有矮秆性状的玉米材料；

15、（2）玉米分子标记辅助育种。

16、上述应用中，所述玉米分子标记辅助育种为：具有矮秆性状的玉米品种选育。

17、上述应用中，筛选或鉴定具有矮秆性状的玉米材料的方法包括以下步骤：

18、以待测玉米的基因组dna为模板，利用seq id no.2所示的上游引物f1、seq idno.3所示的上游引物f2和seq id no.4所示的下游引物r进行pcr扩增，对扩增产物进行测序或凝胶电泳分析；

19、若扩增产物的序列如seq id no.5所示，或者凝胶电泳的条带为691 bp，则判定为具有矮秆性状的玉米突变体；扩增产物的序列具体如下：

20、tggacgatgatgttgcgacttgagatcttcaaacaagcatggattgcttgcactattttatgccatttgaaaactaccttttattgtaatagtctattgtgttgaactatcttgtgctatgttagactcttgtgtgatgtgaacttatcgctattatatttgaactattgtgttagactattgtatgctatgaacttattgttatattgtcttgttgatctatggtctatgtaatgctatattgtatgatgtgttgaatgatgagaacttactgctatattatcatgttggactattgtgttgtatgatgtgaacttattgctatattgtcatgttagaatattacattccatgatgtaaacttattgttatattgtcatgatggactattatgttgcacgatgtaattaatttatgcaccaactgaattatagtgaatgataatcaatgtatgcattatccgataagtacccggtacgcccgactaaatacccggtccctgtatccgtatccgtcccgtttctaactatccgtatccgatcccgtatccgattgaaatacattagggtaggatacgggatgacctactatccgtccgtatccgcccgttttcacccctacatacagcttcctgaatgcagcttccctttacaagatagtgtgtcagttagtttcacccgctagtgaggcc。（seq id no.5）

21、若扩增产物的序列如seq id no.6所示，或者凝胶电泳的条带为274 bp，则判定为野生型玉米材料；扩增产物的序列具体如下：

22、tctggcatcttgatgtgccttgctggaagccttgggaactggaatttacttgtatgatcattctttaggaatttgtaaattatctccatatctacattcaaacatatagcttcccaaaatgcagcctcccttcacaagatagtgtgagtttcacccgctagtgaggccatgttacctgtaagggtgaggcatcaactatcaatcatacagcttcctgaatgcagcttccctttacaagatagtgtgtcagttagtttcacccgctagtgaggcc。（seq id no.6）

23、若凝胶电泳同时出现274 bp和691 bp双条带时，判定为杂合基因型。由于本发明的矮秆表型是由隐性单基因控制，所以杂合基因型的株高表型为高秆。

24、优选的，pcr扩增的反应体系为：0.3 μl浓度为10 μm的seq id no.2所示的上游引物f1，0.3 μl浓度为10 μm的seq id no.3所示的上游引物f2，0.3 μl浓度为10 μm的seq idno.4所示的下游引物r，1 μl浓度为100 ng/μl的基因组dna；5μl 2×taq master mix；3.1μl ddh2o。

25、pcr扩增的反应条件为：5℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min；12℃保存。

26、本发明的上游引物f1是设计在indel-jz24分子标记的插入片段之前，上游引物f2设计在indel-jz24分子标记的插入片段内，因此，野生型玉米材料中只含有上游引物f1，扩增产物的条带大小为274bp；而矮秆性状玉米材料中同时含有f1和f2的序列，但是因为插入indel的原因，f1和r序列之间的碱基长度>5000bp，本发明所用pcr反应条件不能扩增出该片段，因此，矮秆性状玉米材料中扩增出来的是f2和r之间的691 bp的条带。

27、本发明的有益效果：

28、本发明首次从玉米3号染色体上筛选并鉴定获得一个与玉米矮秆性状紧密连锁的indel分子标记。该分子标记与控制玉米矮秆性状的遗传位点紧密连锁，能够较为准确地反映待测玉米材料是否携带目标矮秆等位基因，为玉米矮秆种质的鉴定和利用提供了新的分子检测工具。

29、利用本发明的indel分子标记，可通过pcr扩增对待测玉米材料进行基因型鉴定，无需待植株生长至成株期后再根据株高、节间长度等表型进行判断，能够在苗期实现对矮秆性状的早期预测和选择。本发明的indel分子标记检测方法操作简单，检测周期短，结果易于判定，具有检测效率高、准确率高、重复性好及检测成本较低等优点，适于对大批量玉米育种材料进行快速筛选。