一种小麦线条花叶病毒荧光Rt-PCR检测试剂和方法与流程

本发明属于分子生物学检测，具体涉及一种小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂和方法。

背景技术：

1、小麦线条花叶病毒（wsmv）是严重危害小麦生产的potyviridae科病毒，通过麦曲叶螨传播，可导致小麦产量损失20%-80%。传统检测方法包括症状观察、elisa和常规rt-pcr，但灵敏度低、耗时长。荧光rt-pcr（qrt-pcr）已成为主流，但实际应用中存在显著缺陷。

2、小麦叶片和种子组织富含多糖（淀粉、果胶、葡聚糖等）、酚类/多酚（绿原酸、儿茶素等）、腐殖酸（田间土壤污染引入）等pcr抑制物。这些抑制物通过螯合mg2+、与核酸/酶结合、增加反应体系粘度或干扰荧光信号，导致扩增效率低下、假阴性率高，尤其在低病毒载量或田间复杂样品中问题突出。

3、现有技术多采用常规缓冲液添加t4 gp32、bsa、甜菜碱或dmso，但对小麦特异性抑制物的缓解效果有限，难以实现粗提rna直接检测，且反应时间较长、多重检测稳定性差。离子液体（ils）或深共熔溶剂（des）在pcr中的应用主要针对gc-rich模板或一般dna提取，鲜有针对小麦组织多糖-酚类-腐殖酸复合抑制物的系统优化设计，也未见集成到wsmv一步法多通道qrt-pcr中的报道。

4、因此，亟需开发一种针对小麦组织特异性抑制物进行优化设计的鲁棒性强、灵敏度高、操作简便的检测技术。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，在第一方面，本发明提供了一种小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂，其包含一步法荧光rt-pcr缓冲液，所述缓冲液包含复合添加剂体系，所述复合添加剂体系由第一添加剂和第二添加剂组成；

2、所述第一添加剂为胆碱类深共熔溶剂；

3、所述第二添加剂为咪唑类离子液体。

4、进一步地，所述胆碱类深共熔溶剂由氯化胆碱与甘油按摩尔比1:1~1:2通过氢键自组装形成。

5、进一步地，所述胆碱类深共熔溶剂在所述小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂中的体积分数为1.5%~3.5%（v/v）。

6、进一步地，所述咪唑类离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐。

7、进一步地，所述1-丁基-3-甲基咪唑氯盐在所述小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂中的体积分数为0.5%~1.5%（v/v）。

8、进一步地，所述小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂还包含辅助添加剂，所述辅助添加剂选自牛血清白蛋白、甜菜碱和t4基因32蛋白。

9、进一步地，所述牛血清白蛋白在所述小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂中的浓度为0.05~0.3 mg/ml，所述甜菜碱在所述小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂中的浓度为0.2~0.8 m，所述t4基因32蛋白在所述小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂中的浓度为0.05~0.2 μg/μl。

10、进一步地，所述小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂还包含rt-pcr缓冲剂、mgcl2、dntps。

11、进一步地，所述小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂还包含50~100 mm tris-hcl（ph 8.3~8.8）、3~6 mm mgcl2、0.2~0.4 mm dntps。

12、在第二方面，本发明提供了一种小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂盒，其包含如本文所述的小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂、逆转录酶、dna聚合酶、rnase抑制剂以及针对wsmv的特异性引物对和taqman探针。

13、进一步地，所述针对wsmv的特异性引物对和taqman探针的核苷酸序列为：

14、正向引物 wsmv-f：5'-cgtgttgtgaataatgcaggca-3'（seq id no:1）；

15、反向引物 wsmv-r：5'-cgaagtgatggcttcgcagc-3'（seq id no:2）；

16、taqman探针 wsmv-p：5'-vic-caatgagcagcaact-mgb-3'（seq id no:3）；

17、所述taqman探针的5'端标记有荧光报告基团vic，3'端标记有非荧光淬灭基团及与之相连的mgb修饰基团。

18、进一步地，所述试剂盒还包含植物内参引物对和探针、外源内控rna及其对应的引物对和探针。

19、进一步地，所述植物内参引物对和探针靶向小麦内源18s rrna基因或taef1-α基因，其探针的荧光报告基团标记为cy5或rox。

20、进一步地，所述外源内控rna为人工合成的rna片段，其对应的探针的荧光报告基团标记为rox或cy5。

21、在第三方面，本发明提供了一种使用如本文所述的小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂盒检测小麦线条花叶病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

22、（1）样品裂解处理：取待检小麦组织，加入含1.0%~2.0%（v/v）胆碱类深共熔溶剂的裂解液，室温下进行物理研磨或敲击裂解，静置后获取含有总rna的小麦组织粗提物液体；

23、（2）一步法荧光rt-pcr反应体系构建：在反应管中混合如本文所述的小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂、逆转录酶、dna聚合酶、rnase抑制剂、针对wsmv的特异性引物对和探针、任选的植物内参引物对和探针、任选的外源内控rna及其对应的引物对和探针，以及步骤（1）获得的粗提物液体1~5 μl，以无核酸酶水补足至终体积10~25 μl；

24、（3）扩增与荧光信号采集：将步骤（2）构建的反应管置于荧光定量pcr仪中，依次进行以下反应：50°c~52°c逆转录8~12 min；95°c预变性1~3 min；进行40~45个循环的pcr扩增，每个循环包括95°c变性3~10 s和60°c~63°c退火与延伸20~30 s，并在每个循环的退火延伸阶段同步采集荧光信号；

25、（4）结果判定：依据wsmv探针荧光通道的ct值，判定样品为wsmv阳性或阴性。

26、进一步地，步骤（2）中所述小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂的添加量为反应体系终体积的一半。

27、进一步地，所述步骤（4）的结果判定标准为：如果wsmv探针荧光通道出现典型对数扩增曲线且ct值≤35，和当存在时，植物内参探针和外源内控rna探针所对应的荧光通道均显示正常扩增，则判定样品为wsmv阳性。

28、在第四方面，本发明提供了如本文所述的小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂或小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂盒在wsmv口岸出入境种子检疫、田间病毒病早期诊断与疫情普查、抗病育种材料分子标记辅助筛选中的应用。

29、本发明的有益效果

30、本发明的小麦线条花叶病毒荧光rt-pcr检测试剂通过在常规一步法荧光rt-pcr缓冲液中添加胆碱类深共熔溶剂与咪唑类离子液体，在反应体系中构筑独特的“离子-氢键协同”缓冲微环境，实现对小麦粗提样品中多糖、多酚、腐殖酸复合抑制物的系统性清除，从而在免核酸纯化的前提下实现wsmv的高灵敏度、高特异性和高重复性多通道荧光rt-pcr快速检测。