盐酸丙卡特罗亚硝化相关反应杂质及其制备与检测方法与流程

本发明属于药物杂质分析，具体涉及一种盐酸丙卡特罗亚硝化相关反应杂质、其制备方法及检测方法。

背景技术：

1、盐酸丙卡特罗（procaterol hydrochloride）是一种高选择性的β2肾上腺素受体激动剂，化学名称为（±）-8-羟基-5-[（1rs,2rs）-1-羟基-2-[（1-甲基乙基）氨基]丁基]-2（1h）-喹啉酮盐酸盐半水合物，临床上主要用于支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病（copd）等呼吸系统疾病的治疗，具有起效快、作用持续时间长、副作用小等特点。

2、n-亚硝胺类化合物因其潜在的基因毒性和致癌性，近年来受到全球药品监管机构的高度关注。国际人用药品注册技术协调会（ich）m7（r1）指导原则将n-亚硝胺类化合物列为"关注群组"（cohort of concern，coc），要求对其进行严格的控制。自2018年缬沙坦中检出n-亚硝基二甲胺（ndma）以来，fda和ema已相继在雷尼替丁、二甲双胍、利福平等多款药物中发现n-亚硝胺杂质超标问题，导致多起药品召回事件。

3、盐酸丙卡特罗的分子结构中含有仲胺官能团（-nh-基团），在酸性条件及亚硝化试剂存在的情况下，除可能发生胺基亚硝化反应生成n-亚硝胺类杂质外，其芳香环亦可能发生进一步的亚硝化或氧化相关反应，形成其他亚硝化反应相关杂质。现有技术中，已有针对丙卡特罗n-亚硝基杂质的研究报道。例如，现有技术cn119977883a公开了一种丙卡特罗n-亚硝胺杂质及其制备方法，其采用亚硝酸盐/酸性体系使盐酸丙卡特罗发生亚硝化反应，获得本发明所述的n-亚硝基丙卡特罗（bktl01）。然而，该方法主要针对n-亚硝基化杂质的制备，对于盐酸丙卡特罗在不同亚硝化环境下产生的其他相关杂质，如芳环亚硝基化杂质及芳环硝基化杂质，尚缺少系统研究。此外，现有技术对bktl01的结构确证信息仍存在一定不足，例如公开的核磁共振数据与其所报道结构之间存在不完全对应的情况，导致该化合物的准确结构确认仍有进一步研究的必要。

4、另一方面，现有技术cn120741707a中虽然已有采用高效液相色谱的方法对盐酸丙卡特罗有关物质进行检测的方法，但主要针对常规降解杂质或工艺相关杂质，无法满足亚硝化相关杂质的痕量检测需求。由于缺少相应的杂质标准品及针对性的高灵敏检测方法，导致盐酸丙卡特罗原料药及制剂中潜在亚硝化相关杂质的识别、定量分析及质量控制仍存在一定困难。

5、因此，亟需开发一种能够定向合成盐酸丙卡特罗亚硝化反应相关杂质的方法，以获得结构确证的杂质对照品，并针对关键亚硝化相关杂质建立灵敏、专属、可靠的检测方法，为盐酸丙卡特罗原料药或制剂的杂质研究和质量控制提供技术保障。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中缺少盐酸丙卡特罗亚硝化相关反应杂质对照品、其制备方法和检测手段的问题，本发明采用如下技术方案：

2、第一方面，本发明提供一种盐酸丙卡特罗亚硝化相关反应杂质bktl02。所述bktl02为盐酸丙卡特罗经亚硝化反应产生的芳环亚硝基化杂质，其化学结构式如下：

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4、所述bktl02可作为盐酸丙卡特罗原料药或制剂中亚硝化相关反应杂质检测的对照品，用于目标杂质的定性分析和定量检测。

5、第二方面，本发明提供一种盐酸丙卡特罗亚硝化反应相关杂质的制备方法，该方法以盐酸丙卡特罗为起始原料，在不同反应条件下与亚硝化试剂反应，分别制备三种相关杂质：n-亚硝基丙卡特罗（bktl01）、芳环亚硝基化杂质（bktl02）和芳环硝基化杂质（bktl03）。其中bktl01、bktl03的化学结构式如下图所示：

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7、具体制备路线为：

8、方案a（亚硝酸钠/0.01m盐酸体系）：将盐酸丙卡特罗溶于0.01 mol/l盐酸水溶液中，冰浴搅拌条件下加入亚硝酸钠（5eq）水溶液，继续冰浴搅拌30 min后，恢复至室温反应12 h。经冰水淬灭、乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、减压浓缩后，通过高压制备液相色谱纯化，获得n-亚硝基丙卡特罗（bktl01），为灰白色固体。

9、方案b（亚硝酸钠/4m盐酸体系）：将盐酸丙卡特罗溶于4 mol/l盐酸水溶液中，冰浴搅拌条件下加入亚硝酸钠（5eq）水溶液，继续冰浴搅拌30 min后，恢复至室温反应2 h。经与方案a相同的后处理和纯化，得到n-亚硝基丙卡特罗（bktl01）和芳环亚硝基化杂质（bktl02）。

10、方案c（nobf4/乙腈体系）：将盐酸丙卡特罗溶于无水乙腈中，室温（25℃）搅拌条件下加入四氟硼酸亚硝鎓盐（nobf4，5eq），室温反应3 h。经与方案a相同的后处理和纯化，主要得到芳环硝基化杂质（bktl03），为橙色固体。

11、方案d（tbn/乙腈体系）：将盐酸丙卡特罗溶于无水乙腈中，室温搅拌条件下加入亚硝酸叔丁酯（tbn，5eq），室温反应4 h。经与方案a相同的后处理和纯化，同时得到bktl01和bktl02。

12、第三方面，本发明提供一种用于检测盐酸丙卡特罗原料药或制剂中n-亚硝基丙卡特罗（bktl01）的hplc-ms/ms检测方法，采用c18色谱柱，以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱；质谱检测采用电喷雾离子源（esi）负离子模式和选择反应监测（srm）模式，以bktl01的离子对m/z 318.1→188.0进行定量分析。该方法经系统适用性、专属性、定量限、检测限、线性与范围、重复性、准确度和溶液稳定性等方法学验证，各项指标符合《中国药典》相关要求。

13、本发明相较于现有技术，有益效果在于：

14、（1）本发明建立了盐酸丙卡特罗亚硝化反应相关杂质的制备方法，获得了bktl01、bktl02及bktl03杂质对照品，所得产物具有较高纯度，可用于盐酸丙卡特罗药物中潜在亚硝化相关反应杂质的结构确证、标准品制备及质量研究。

15、（2）本发明通过构建不同亚硝化反应体系，建立了反应条件与杂质生成类型之间的对应关系，弱氧化条件下（0.01m hcl/nano2）主要生成n-亚硝基化产物bktl01；中等氧化条件下（4m hcl/nano2或tbn/乙腈）bktl01和bktl02共存；强氧化条件下（nobf4/乙腈）主要生成芳环硝基化产物bktl03，实现了不同类型相关杂质的制备。

16、（3）本发明建立了盐酸丙卡特罗制剂中n-亚硝基丙卡特罗（bktl01）的hplc-ms/ms检测方法，通过高效液相色谱分离结合串联质谱选择反应监测（srm）检测，实现了对bktl01的定性和定量分析。该方法具有较高的灵敏度和良好的线性关系，检测限为1.434 ng/ml，定量限为4.779 ng/ml，线性相关系数r2达到0.9997，经专属性、精密度、准确度及稳定性验证，可用于盐酸丙卡特罗制剂中n-亚硝基丙卡特罗的质量控制。

1.一种盐酸丙卡特罗亚硝化相关反应杂质，所述杂质为bktl02，其化学结构式如下：

2.一种盐酸丙卡特罗亚硝化相关反应杂质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述亚硝化试剂选自亚硝酸钠(nano2)、四氟硼酸亚硝鎓盐(nobf4)或亚硝酸叔丁酯(tbn)中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：当所述亚硝化试剂为亚硝酸钠(nano2)时，步骤(1)中所述反应溶剂为盐酸水溶液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：当盐酸浓度为0.01 mol/l时，生成n-亚硝基丙卡特罗（bktl01）。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：当盐酸浓度为4 mol/l时，生成n-亚硝基丙卡特罗（bktl01）和芳环亚硝基化杂质（bktl02）。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：当所述亚硝化试剂为亚硝酸叔丁酯(tbn)时，反应溶剂为无水乙腈，生成n-亚硝基丙卡特罗（bktl01）和芳环亚硝基化杂质（bktl02）。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：当所述亚硝化试剂为四氟硼酸亚硝鎓盐(nobf4)时，反应溶剂为无水乙腈，生成芳环硝基化杂质（bktl03）。

9.一种芳环硝基化丙卡特罗杂质bktl03的制备方法，其特征在于，包括：将盐酸丙卡特罗溶于无水乙腈中，加入四氟硼酸亚硝鎓盐(nobf4)进行反应，经纯化得到bktl03。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：四氟硼酸亚硝鎓盐(nobf4)与盐酸丙卡特罗的摩尔比为5:1。

11.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于：反应温度为20～30℃，反应时间为3小时。

12.根据权利要求1所述的化合物bktl02在盐酸丙卡特罗亚硝化反应相关杂质检测中作为杂质对照品的应用。

13.一种盐酸丙卡特罗中n-亚硝基丙卡特罗（bktl01）的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，液相色谱条件及质谱条件如下：