一种微生物污染快速检测试剂盒及其在细胞制剂微生物污染检测中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学检测，具体涉及一种微生物污染快速检测试剂盒及其在细胞制剂微生物污染检测中的应用。

背景技术：

1、细胞制剂作为细胞治疗、再生医学及生物制药领域的核心产品，其质量安全直接关系到患者的生命健康。微生物污染是细胞制剂生产过程中最常见且最严重的质量问题之一，主要包括细菌、支原体、衣原体和真菌等。根据《中国药典》及国际相关法规要求，细胞制剂在放行前必须进行严格的无菌检测和支原体检测。

2、目前，细胞制剂微生物污染检测主要采用传统培养法和单一pcr检测法。传统培养法是微生物检测的金标准，但细菌培养需要7~14天，支原体培养需要21~28天，部分难培养或不可培养微生物难以检出，因而传统培养法存在检测周期长和检测灵敏度有限的缺陷。单一pcr检测法主要是针对单一病原体进行检测，需要多次检测才能完成对全部微生物的检测，细胞制剂样品往往十分珍贵，多次检测造成样品浪费，多次检测则会增加操作复杂度和污染风险，因而单一pcr检测法存在检测通量低、样品消耗大和操作繁琐的缺陷。

3、虽然现有技术已有尝试利用多重pcr检测法检测细胞制剂中的细菌、支原体、衣原体和真菌微生物污染，但普遍存在多重引物之间的相互干扰导致扩增效率下降、荧光通道之间的光谱串扰影响检测准确性的问题。

4、因此，开发一种能够同时检测多种微生物、检测周期短、灵敏度高、特异性强的细胞制剂微生物污染快速检测试剂盒具有重要的实际应用价值。

技术实现思路

1、为了解决利用传统培养法检测微生物污染过程中存在的检测周期长和检测灵敏度有限、单一pcr检测法检测微生物污染过程中存在的检测通量低、样品消耗大和操作繁琐以及多重pcr检测法检测微生物污染过程中存在的多重引物之间的相互干扰导致扩增效率下降、荧光通道之间的光谱串扰影响检测准确性的问题，本发明提供一种微生物污染快速检测试剂盒及其在细胞制剂微生物污染检测中的应用。

2、根据本发明的第一个方面，提供一种微生物污染快速检测试剂盒，该试剂盒包括试剂a、试剂b、试剂c和试剂d；

3、试剂a用于检测细菌，试剂a包括第一上游引物、第一下游引物和第一检测探针，第一上游引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，第一下游引物的核苷酸序列如seq id no：2所示，第一检测探针的核苷酸序列如seq id no：3所示；

4、试剂b用于检测支原体，试剂b包括第二上游引物、第二下游引物和第二检测探针，第二上游引物的核苷酸序列如seq id no：4所示，第二下游引物的核苷酸序列如seq idno：5所示，第二检测探针的核苷酸序列如seq id no：6所示；

5、试剂c用于检测衣原体，试剂c包括第三上游引物、第三下游引物和第三检测探针，第三上游引物的核苷酸序列如seq id no：7所示，第三下游引物的核苷酸序列如seq idno：8所示，第三检测探针的核苷酸序列如seq id no：9所示；

6、试剂d用于检测真菌，试剂d包括第四上游引物、第四下游引物和第四检测探针，第四上游引物的核苷酸序列如seq id no：10所示，第四下游引物的核苷酸序列如seq id no：11所示，第四检测探针的核苷酸序列如seq id no：12所示。

7、本技术发明人分别针对细菌16s rdna、支原体16s rdna、衣原体ompa基因及真菌its2区域设计引物和taqman探针，经过筛选后得到用于检测细菌的第一上游引物、第一下游引物和第一检测探针（试剂a）、用于检测支原体的第二上游引物、第二下游引物和第二检测探针（试剂b）、用于检测衣原体的第三上游引物、第三下游引物和第三检测探针（试剂c）、用于检测真菌的第四上游引物、第四下游引物和第四检测探针（试剂d），以上述试剂a、试剂b、试剂c和试剂d作为试剂盒的组分，得到本发明提供的微生物污染快速检测试剂盒。

8、利用本发明提供的微生物污染快速检测试剂盒，通过多重实时荧光定量pcr以及多通道荧光信号可以同时对细菌、支原体、衣原体、真菌这四类微生物污染进行高灵敏度、高特异性检测，检测限高达101~102copies/反应（相当于1~10 cfu/ml的检测灵敏度），显著优于传统培养法，单次检测仅需100~1000 μl待测样品，可以显著减少珍贵样品的消耗，并且，各引物和探针对目标微生物具有高度特异性，各引物和探针之间无交叉反应，此外，利用本发明提供的试剂盒对细菌、支原体、衣原体、真菌这四类微生物进行检测过程中，检测时间仅需2~3小时（含样品处理），相比传统培养法而言显著缩短了检测周期。

9、优选地，第一检测探针、第二检测探针、第三检测探针、第四检测探针均含有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团选自cy5、fam、vic、rox中的其中一种，淬灭基团选自bhq1、bhq3、mgb中的其中一种。

10、优选地，荧光基团位于第一检测探针、第二检测探针、第三检测探针、第四检测探针的5’端，淬灭基团位于第一检测探针、第二检测探针、第三检测探针、第四检测探针的3’端。

11、优选地，第一检测探针的5’端标记有荧光基团cy5，第一检测探针的3’端标记有淬灭基团bhq3；第二检测探针的5’端标记有荧光基团fam，第二检测探针的3’端标记有淬灭基团bhq1；第三检测探针的5’端标记有荧光基团vic，第三检测探针的3’端标记有淬灭基团bhq1；第四检测探针的5’端标记有荧光基团rox，第四检测探针的3’端标记有淬灭基团mgb。

12、在第一检测探针、第二检测探针、第三检测探针、第四检测探针的5’端分别标记荧光基团cy5、fam、vic、rox，同时在3’端采用bhq系列淬灭基团或mgb淬灭基团，在pcr延伸过程中taq dna聚合酶的5’→3’外切酶活性会水解与模板结合的检测探针，使荧光基团与淬灭基团物理分离并释放荧光信号，通过采集检测体系中的荧光信号可以实现对细菌、支原体、衣原体、真菌这四类微生物进行同时检测的目的。并且，cy5、fam、vic、rox这四种荧光基团的发射光谱峰间距较大，分离度好，在荧光信号采集过程中能够最大程度地减少光谱重叠，使细菌（cy5）、支原体（fam）、衣原体（vic）、真菌（rox）的信号能够被仪器无干扰地独立采集和分析，从根本上避免了假阳性的交叉判读，保证了四重检测的特异性和准确性。此外，细菌16s rdna拷贝数较高且背景复杂，使用长波长、本底干扰相对较少的cy5通道，支原体和衣原体的丰度一般较低，采用更为灵敏的fam和vic通道，真菌则采用的rox通道，通过上述搭配有助于在检测过程中获得更稳定的荧光信号，从而提高检测灵敏度和准确性。

13、优选地，上述试剂盒还包括内参质控品，内参质控品含有人源β-actin基因片段。

14、优选地，上述试剂盒还包括试剂e，试剂e用于检测所述内参质控品，试剂f包括第五上游引物、第五下游引物和第五检测探针，第五上游引物的核苷酸序列如seq id no：13所示，第五下游引物的核苷酸序列如seq id no：14所示，第五检测探针的核苷酸序列如seqid no：15所示。

15、β-actin是看家基因，在所有人源细胞中稳定表达。

16、本方案提供的试剂盒通过引入内参质控品及针对该内参质控品的引物和探针，该内参质控品可以是含有人源β-actin基因片段的重组质粒或合成dna片段，在利用该试剂盒检测含人源细胞的样品时，该内参质控品及针对该内参质控品的引物和探针可以有效识别pcr反应抑制、核酸提取失败、样品降解等情况，避免假阴性检测结果的产生，有利于保证最终检测的结果的可靠性。

17、优选地，上述试剂盒还包括阳性质控品，阳性质控品包括第一质粒、第二质粒、第三质粒和第四质粒，第一质粒含有大肠杆菌atcc 25922基因组dna或16s rdna片段，第二质粒含有口腔支原体atcc 23714基因组dna或16s rdna片段，第三质粒含有沙眼衣原体atccvr-902b基因组dna或ompa基因片段，第四质粒含有白色念珠菌atcc 10231基因组dna或its2片段。

18、本方案提供的试剂盒通过引入含有大肠杆菌基因组dna或16s rdna片段的第一质粒、含有口腔支原体基因组dna或16s rdna片段的第二质粒、含有沙眼衣原体基因组dna或ompa基因片段的第三质粒以及有白色念珠菌基因组dna或its2片段的第四质粒，以上述四种质粒作为阳性质控品，不仅可检测扩增反应液的质量，还可获得检测试剂（即试剂盒中的引物和探针）的检测的下限信息。

19、优选地，上述试剂盒还包括试剂f，试剂f包括叠氮溴化丙锭（pma）溶液，叠氮溴化丙锭溶液的浓度为20~100 μm。

20、pma是一种核酸嵌入染料，能够穿透死细胞受损的细胞膜进入细胞内部，与dna发生共价交联。经光照活化后，pma能够与dna形成稳定的共价键，在后续pcr扩增过程中阻止dna聚合酶的延伸，从而抑制死菌dna的扩增。而活细胞由于细胞膜完整，pma无法进入，因此活菌dna不受影响，可正常扩增。

21、被活的微生物污染的待测样品（例如细胞制剂）会存在感染风险，不得使用，而被死的微生物污染的待测样品则可以通过进一步评估残留内毒素/抗原风险，指导后续处理。

22、本方案通过在试剂盒中引入pma，利用pma对待测样品进行预处理，通过比较pma处理组和未处理组的结果，可以对待测样品中的微生物的死活状态进行快速判定，这对于细胞制剂等待测样品的应用具有重要的临床意义。

23、优选地，上述试剂盒还包括试剂g，试剂g包括如下组分：0.02~0.05 u/μl热启动taq dna聚合酶，200~400 μm dntps混合物，40~60 mm kcl溶液，0.01~0.02 u/μl 尿嘧啶dna糖基化酶（ung酶），200~400 μm dutp，镁盐溶液，tris-hcl缓冲液，稳定剂；镁盐溶液中的mg2+浓度为2~4 mm；tris-hcl缓冲液的ph值为8.3~8.5、浓度为10~20 mm；稳定剂包括如下组分：0.1~0.5 mg/ml牛血清白蛋白（bsa），0.5~1.5 m甜菜碱。

24、在试剂盒中引入含上述组分的pcr反应预混液（即试剂g），在对待测样品进行检测过程中，试剂g能够为pcr扩增适宜的化学环境，使pcr扩增反应得以稳定进行，从而提高了pcr扩增效率及微生物检测效率。并且，试剂g以预混液的形式存在，可以减少操作步骤，降低人为误差。

25、优选地，上述试剂盒还包括试剂h，试剂h包括如下组分：裂解液，结合液，洗涤液i，洗涤液ii，洗脱液；裂解液含有蛋白酶k、十二烷基硫酸钠（sds）、乙二胺四乙酸（edta）；结合液含有3~5 m第一盐溶液、0.5~1 m第二盐溶液和20~50 mm tris-hcl，第一盐溶液含有盐酸胍或异硫氰酸胍，第二盐溶液含有氯化钠或醋酸钠，tris-hcl的ph值为6.0~6.5；洗涤液i含有20~35% (v/v)乙醇溶液、3~5 m第一盐溶液、0.5~1 m第二盐溶液和20~50 mm tris-hcl溶液，第一盐溶液含有盐酸胍或异硫氰酸胍，第二盐溶液含有氯化钠或醋酸钠，tris-hcl溶液的ph值为6.0~6.5；洗涤液ii为质量分数为75%的乙醇溶液；洗脱液为低盐tris-edtabuffer（低盐te缓冲液）或无菌水，低盐te缓冲液含有8~12 mm tris-hcl溶液和0.1~1 mm乙二胺四乙酸（edta）溶液，edta溶液的ph值为8.0~9.0。

26、根据本发明的第二个方面，提供上述微生物污染快速检测试剂盒在细胞制剂微生物污染检测中的应用。

27、将本发明提供的微生物污染快速检测试剂盒应用于细胞制剂微生物污染检测中，通过多重实时荧光定量pcr以及多通道荧光信号可以实现对细菌、支原体、衣原体、真菌这四类微生物污染的高灵敏度、高特异性检测。