抗TL1A/IL-23双特异性抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及一种抗tl1a/il-23双特异性抗体及其用途。

背景技术：

1、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)是一种特殊的慢性炎症性肠道疾病，包括克罗恩病(crohn’s disease，cd)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)。炎症性肠病的病因和发病机制尚不明确，普遍认为是由多种因素相互作用，如肠黏膜免疫调节异常、持续性肠道感染、肠黏膜屏障缺损、遗传和环境因素。肠黏膜固有性和适应性免疫应答共同参与ibd的病变形成过程，肠黏膜异常的免疫应答是引起黏膜组织损伤的重要原因。

2、tl1a(又称肿瘤坏死因子超家族成员15[tnfsf15])是tnf配体超家族的成员，与其他成员一样，是同源三聚体。tl1a是ii型跨膜蛋白，它以膜结合形式和可溶性形式存在，其受体亦有dr3和可溶性诱杀受体3(decoy receptor 3，dcr3)两种。dr3又称apo3、lard或wsl1，是肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，tnfrsf)成员。tl1a是dr3的配体，结合后能够诱导核因子-κb(nuclear factor-kappa b，nf-κb)活化，促进炎症因子的转录并激活凋亡蛋白酶，进而发挥促炎和促凋亡作用；dcr3竞争性地与tl1a结合，从而消弱t细胞协同刺激信号的产生，发挥抗凋亡及抑制促炎因子分泌的作用。

3、近年研究发现，tl1a可通过影响肠道上皮固有层t细胞的活化、增殖、促进th1细胞的极化及效应功能，上调如ifn-γ、tnf-α、il-17、il-22、il-1b、il-4、il-13、il-6以及tgf-b等多种炎症因子的表达，从而促进肠黏膜的炎症反应和纤维化的发生。同时，tl1a还可作用于th17细胞使其分泌il-17增加，导致肠黏膜免疫失调引发肠道炎症反应，而慢性炎症反应是肠纤维化发生的首发因素，炎症反应可进一步激活肠成纤维细胞的活化，产生大量细胞外基质(如胶原蛋白i和iii)，以致肠纤维化的形成。

4、il-23是一种由先天免疫细胞(如树突状细胞和巨噬细胞)产生的促炎性细胞因子，属于il-12细胞因子家族。它由两个亚单位组成：p19(il-23特异性亚单位)和p40(与il-12共享的亚单位)。il-23通过与受体复合物il-23r和il-12rβ1结合，激活下游的jak-stat信号通路，进而促进th17细胞的分化和增殖。th17细胞是炎症反应的关键调节者，能够分泌il-17、il-22等促炎性细胞因子，参与多种自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病的发病机制。研究表明，il-23在ibd的发病机制中起着核心作用。il-23通过促进th17细胞的活化和维持，导致肠道黏膜中il-17和il-22等促炎性细胞因子的过度产生，从而引发肠道炎症和组织损伤。此外，il-23还直接作用于固有层中的先天免疫细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)，进一步放大炎症反应。因此，il-23被认为是ibd治疗的重要靶点。

5、由于tl1a和il-23因子在ibd致病分子机制上是不完全重叠的，因此靶向这两个靶点的双抗预期将在更广泛的ibd患者人群中获得积极疗效。

6、因此，本领域迫切需要开发同时靶向tl1a和il-23的双特异性抗体。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供同时靶向tl1a和il-23的双特异性抗体。

2、在本发明的第一方面，提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：

3、第一抗原结合结构域d1；和

4、第二抗原结合结构域d2；

5、所述d1为特异性结合抗原il-23p19的抗体或抗原结合片段，d2为特异性结合抗原tl1a的抗体或抗原结合片段。

6、在另一优选例中，所述抗体包括：纳米抗体、嵌合抗体、鼠源抗体、人源化抗体。

7、在另一优选例中，所述的抗原结合片段包含fab片段、f(ab')2片段、fv片段、单链fv(scfv)。

8、在另一优选例中，所述的d1和/或d2为scfv。

9、在另一优选例中，所述的d1和/或d2为igg抗体。所述igg抗体为igg1、igg2、igg3或igg4抗体。

10、在另一优选例中，所述d1为抗il-23p19的scfv，所述d2为抗tl1a的igg抗体，其中所述抗il-23p19的scfv通过接头与抗tl1a的igg抗体相连。

11、在另一优选例中，所述d1包含一个、两个、三个或多个抗il-23p19的scfv。

12、在另一优选例中，所述d1包含两个抗il-23p19的scfv。

13、在另一优选例中，所述d2为igg抗体。

14、在另一优选例中，所述d1连接至d2的n端或c端。

15、在另一优选例中，所述d1和所述d2通过接头相连或直接相连。

16、在另一优选例中，所述抗il-23p19的scfv与抗tl1a的igg抗体的重链可变区相连。

17、在另一优选例中，所述抗il-23p19的scfv与抗tl1a的igg抗体的重链恒定区相连。

18、在另一优选例中，所述双特异性抗体为同源二聚体或异源二聚体。

19、在另一优选例中，所述双特异性抗体为同源二聚体。

20、在另一优选例中，所述双特异性抗体包含单体，所述单体从n端到c端具有式(i)、(ii)、(iii)或(iv)所示的结构：

21、

22、其中，

23、vla表示抗il-23p19抗体的轻链可变区；

24、vha表示抗il-23p19抗体的重链可变区；

25、vlb表示抗tl1a抗体的轻链可变区；

26、vhb表示抗tl1a抗体的重链可变区

27、ch1、ch2、ch3表示抗tl1a抗体的重链恒定区；

28、cl表示抗tl1a抗体的轻链恒定区；

29、l1以及l2表示接头；

30、“～”表示二硫键或共价键；

31、“-”表示肽键。

32、在另一优选例中，接头l1的序列为(g4s)n，较佳地，n为1-5。

33、在另一优选例中，接头l2的序列为(g4s)n，较佳地，n为1-5。

34、接头l1与接头l2的序列可以相同也可以不同。

35、在另一优选例中，所述抗il-23p19抗体的轻链可变区vla包含如seq id no:7所示的氨基酸序列。

36、在另一优选例中，所述抗il-23p19抗体的重链可变区vha包含如seq id no:8所示的氨基酸序列。

37、在另一优选例中，所述抗tl1a抗体重链互补决定区的氨基酸序列为hcdr1：gytmn(seq id no：17)、hcdr2：linpysggtnynqkfkg(seq id no：18)和hcdr3：iyqrhdgiay(seq idno：19)，轻链互补决定区的氨基酸序列为lcdr1：sasssvnymh(seq id no：20)、lcdr2：dtsklas(seq id no：21)和lcdr3：qqwssspyt(seq id no：22)(依据kabat规则确定)。

38、在另一优选例中，所述抗tl1a抗体的重链可变区序列具有seq id no:9所示的序列。

39、在另一优选例中，所述抗tl1a抗体的轻链可变区序列具有如seq id no:10所示的序列。

40、在另一优选例中，所述重链恒定区选自人igg1、人igg2、人igg3或人igg4。

41、在另一优选例中，所述轻链恒定区选自人κ(kappa)或人λ(lambda)。

42、在另一优选例中，所述双特异性抗体的重链具有如seq id nos:1～4任一项所示的序列，或与seq id nos：1-4任一项具有至少80％同一性的序列；和/或轻链具有如seq idno:5所示的序列，或与seq id no:5具有至少80％同一性的序列。

43、在另一优选例中，所述双特异性抗体包括所述双特异性抗体的活性片段，其保留了所述双特异性抗体的70-100％(如70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的抗il-23p19活性和70-100％(如70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的抗tl1a活性。

44、在另一优选例中，所述双特异性抗体的序列包含一个或几个氨基酸残基的缺失、插入和/或取代，且与seq id no：1～5中任一项所示的序列具有至少85％的同一性；其中，所述同一性可为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

45、在另一优选例中，所述氨基酸残基的取代为保守性氨基酸取代。

46、在另一优选例中，所述氨基酸残基的缺失、插入和/或取代位于框架区或恒定区。

47、在另一优选例中，所述的双特异性抗体的重链氨基酸序列如seq id no:1所示，轻链氨基酸序列如seq id no:5所示。

48、在另一优选例中，所述的双特异性抗体的重链氨基酸序列如seq id no:2所示，轻链氨基酸序列如seq id no:5所示。

49、在另一优选例中，所述的双特异性抗体的重链氨基酸序列如seq id no:3所示，轻链氨基酸序列如seq id no:5所示。

50、在另一优选例中，所述的双特异性抗体的重链氨基酸序列如seq id no:4所示，轻链氨基酸序列如seq id no:5所示。

51、在本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码如本发明第一方面所述的双特异性抗体。

52、在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如seq id nos:11-15任一项所示。

53、在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第二方面所述的多核苷酸分子。

54、在另一优选例中，所述表达载体为病毒或质粒，较佳地为慢病毒，噬菌体或者噬菌粒。

55、在另一优选例中，所述表达载体选自下组：pcdna3.4，pdr1，pcdna3.1(+)，pcdna3.1/zeo(+)，pdhfr，ptt5，pdhff，pgm-csf或pcho 1.0，较佳地为pcdna3.4。

56、在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的表达载体。

57、在另一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞，优选cho细胞或293f细胞。

58、在本发明的第五方面，提供了一种如本发明第一方面所述的双特异性抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

59、a)在表达条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达双特异性抗体；

60、b)分离并纯化步骤a)所述的双特异性抗体。

61、在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本发明第一方面所述的双特异性抗体。

62、在本发明的第七方面，提供了如本发明第一方面所述的双特异性抗体、或如本发明第六方面所述的药物组合物在制备治疗炎性疾病或病症的药物中的用途。

63、在另一优选例中，所述炎性疾病或病症包括胃肠道、皮肤的疾病或病症。

64、在另一优选例中，所述胃肠道的疾病或病症为炎症性肠病。进一步优选为克罗恩病或溃疡性结肠炎。

65、在另一优选例中，所述皮肤的疾病或病症为银屑病。

66、在本发明的第八方面，提供了一种治疗炎性疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本发明第一方面所述的双特异性抗体、如本发明第六方面所述的药物组合物。

67、在另一优选例中，所述方法还包括和其他的治疗炎性疾病或病症的药物联合给药。

68、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。