一种用于阿胶、猪皮胶和牛皮胶中动物源性成分三重检测的LMTIA引物探针组合及其应用

本发明涉及分子检测，特别是涉及一种用于阿胶、猪皮胶和牛皮胶中动物源性成分三重检测的lmtia引物探针组合及其应用。

背景技术：

1、阿胶（cca）是以马科动物驴（equus asinus l.）的干燥皮为原料，经煎煮、浓缩制成的固体胶块，为我国传统名贵中药材。cca的药用历史可追溯至汉代，《神农本草经》将其列为上品，距今已有近三千年应用历史。cca性平味甘，归肺、肝、肾经，传统功效以补血滋阴、润燥止血为主，临床广泛用于血虚萎黄、眩晕心悸、心烦失眠、肺燥咳嗽及月经不调、妊娠胎漏等妇科疾病的治疗。现代药理研究表明，cca富含胶原蛋白水解产物及多种氨基酸和微量元素，具有促进造血、调节免疫功能、抗衰老、抗休克等多种药理活性。

2、cca的原材料是驴皮，其传统制造工艺包括数十个连续的步骤，包括浸皮、脱毛、煎煮、浓缩、凝胶化、块状切割和风干，这使得工作流程非常复杂，技术要求很高。然而，驴不是我国主要的牲畜品种，其繁殖率低和饲养周期长导致了驴兽皮供应的严重短缺，加剧了cca市场的掺假和欺诈现象。由于牛、马和猪皮明胶的形态特征和物理化学性质与真正的cca非常相似，不法制造商经常用更便宜的动物皮明胶替代或掺假驴皮明胶。更令人担忧的是，一些不合格产品是由皮革行业的废皮革生产的，引入了重金属和化学残留物等安全隐患。造假的cca不仅会影响其疗效，还可能增加患严重传染病的风险。市场假冒现象普遍存在，严重扰乱了cca行业的标准化发展，损害了正品cca药材的市场信誉，成为制约cca中药行业高质量发展的关键瓶颈。因此，建立快速、准确、灵敏的阿胶真伪鉴定方法具有十分重要的现实意义。

3、针对cca真伪鉴别问题，鉴定手段从传统感官鉴别逐步发展为分子生物学、光谱分析及质谱技术等多学科交叉的技术体系。传统的识别方法主要依赖于感官评估，包括外观、气味、质地和熔融状态，这些评估简单方便，但高度依赖于检查员的经验，主观性强，准确性低，无法识别细微的掺假。高效液相色谱法（hplc）和液相色谱-串联质谱法（lc-ms/ms），特别是《中国药典》规定的基于肽的分析，能够准确鉴定cca及其掺假品。然而，这些仪器方法需要复杂的设备和熟练的人员，限制了它们对常规或现场检查的适用性。红外光谱，包括近红外（nir）和空间偏移可见近红外光谱，结合化学计量学算法，已被探索用于快速、无损的认证。基于dna的方法，如聚合酶链式反应（pcr）和dna条形码，提供了高的物种特异性。新兴技术包括蛋白质电泳、核磁共振（nmr）和基于特征肽抗体的免疫测定，这些技术有望实现更简单、更具成本效益的现场检测。尽管上述方法具有优点，但也存在局限性，例如加工过程中的dna降解，这会影响检测率，特定肽段的数据库不完整，仪器检测成本高。因此，迫切需要开发一种快速、准确、低成本、可靠的cca真实性鉴定技术方法，以弥补现有技术的不足。

4、梯型熔解温度核酸等温扩增（ladder-shape melting temperature isothermalamplifiction, lmtia）是一种新型核酸等温扩增技术，可在30分钟内实现核酸的稳定扩增，具有较高的灵敏度和特异性。而目前尚未有关于lmtia技术在cca源性成分检测上的报道。将lmtia技术用于阿胶（cca）、猪皮胶（psg）和牛皮胶（og）中动物源性成分三重检测具有十分重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于阿胶、猪皮胶和牛皮胶中动物源性成分三重检测的lmtia引物探针组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明以驴、猪、牛的催乳素受体基因序列为靶序列，通过精心设计lmtia引物和proofman探针，结合三重proofman-lmtia技术，实现在恒温条件下对阿胶、猪皮胶和牛皮胶中动物源性成分的快速扩增反应。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种用于阿胶、猪皮胶和牛皮胶中动物源性成分三重检测的lmtia引物探针组合，包括如seq id no.1所示的cca-f，如seq id no.2所示的cca-b，如seq idno.3所示的cca-lb，如seq id no.4所示的cca-lf，如seq id no.5所示的cca probe，如seqid no.6所示的psg-f，如seq id no.7所示的psg-b，如seq id no.8所示的psg-lb，如seqid no.9所示的psg-lf，如seq id no.10所示的psg probe，如seq id no.11所示的og-f，如seq id no.12所示的og-b，如seq id no.13所示的og-lb，如seq id no.14所示的og-lf，如seq id no.15所示的og probe。

4、可选的，所述cca probe、所述psg probe和所述og probe上连接有不同的荧光基团。

5、本发明还提供上述lmtia引物探针组合在制备检测阿胶、猪皮胶和牛皮胶中动物源性成分的产品中的应用。

6、可选的，所述产品包括试剂、试剂盒或芯片。

7、本发明还提供一种检测阿胶、猪皮胶和牛皮胶中动物源性成分的试剂盒，所述试剂盒中包含有上述lmtia引物探针组合。

8、本发明还提供一种检测阿胶、猪皮胶和牛皮胶中动物源性成分的方法，包括如下步骤：

9、提取待测样品的基因组dna；以所述基因组dna为模板，采用上述试剂盒进行扩增反应，观察荧光信号和扩增曲线；

10、若有与cca probe连接的荧光基团颜色相同的荧光信号和扩增曲线，表明所述待测样品中含有驴源性成分；若有与psg probe连接的荧光基团颜色相同的荧光信号和扩增曲线，表明所述待测样品中含有猪源性成分；若有与og probe连接的荧光基团颜色相同的荧光信号和扩增曲线，表明所述待测样品中含有牛源性成分。

11、进一步地，所述扩增反应的反应体系为：3µl 1× pre-mix buffer，0.1µl bst酶，0.4µl mgso4，0.16µl cca-f，0.16µl psg-f，0.16µl og-f，0.16µl cca-b，0.16µl psg-b，0.16µl og-b，0.04µl cca-lb，0.04µl psg-lb，0.04µl og-lb，0.04µl cca-lf，0.04µlpsg-lf，0.04µl og-lf，0.1µl cca probe，0.1µl psg probe，0.1µl og probe，1µl 基因组dna，ddh2o补至10 µl。

12、进一步地，所述cca-f、psg-f、og-f、cca-b、psg-b、og-b、cca-lb、psg-lb、og-lb、cca-lf、psg-lf、og-lf的浓度均为100µm，所述cca probe、psg probe、og probe的浓度均为10µm。

13、进一步地，所述扩增反应的温度为61℃，时间为20min。

14、本发明还提供上述lmtia引物探针组合、上述试剂盒在阿胶药材真假鉴定或掺假鉴定中的应用。

15、本发明公开了以下技术效果：

16、本发明建立了一种用于阿胶、猪皮胶和牛皮胶中动物源性成分三重检测的lmtia引物探针组合及其应用。本发明以驴、猪、牛的催乳素受体基因序列为靶序列，通过精心设计lmtia引物和proofman探针，结合三重proofman-lmtia技术，实现在恒温条件下对阿胶、猪皮胶和牛皮胶中动物源性成分的快速扩增反应。本发明的引物探针组合对马、羊、鸡、鸭、鱼等非目标物种均无交叉扩增，并能有效区分混合样品中的三种胶类成分。应用于市售阿胶样品的鉴定时，可准确判别正品阿胶及掺伪品，为胶类中药材的质量控制和现场快速筛查提供高效、经济的技术手段。

17、本发明建立的lmtia检测方法可摆脱热循环仪的依赖，不易出现假阳性，兼顾高灵敏度和高特异性，而且极大地简化了检测流程，降低了成本，缩短了检测时间，有助于提升食品药品监管部门对阿胶产品的有效监管，具有广泛的应用前景。