一种胡萝卜全基因组5K液相育种芯片及其专用探针组合和应用的制作方法

本发明涉及胡萝卜品种鉴定，具体涉及胡萝卜全基因组5k 液相育种芯片及其专用检测5237个单核苷酸多态性变异位点基因型的探针组合和应用。

背景技术：

1、胡萝卜（daucus carota l.）是重要的根菜类蔬菜作物，因其富含β-胡萝卜素及其特有的聚乙炔类化合物，对维护视力健康与增强机体免疫功能具有显著功效，被誉为“蔬菜皇冠”。胡萝卜属于是全球性蔬菜，在欧美、日韩、南亚及东南亚地区消费需求旺盛，深受国际市场青睐。近年来，随着国民健康饮食意识的提升，胡萝卜已成为我国蔬菜产业的重要组成部分。我国年种植胡萝卜约800万亩，产量近2000万吨，占世界总产量的45%以上。然而，胡萝卜起源于国外，国内胡萝卜资源遗传基础狭窄，育种技术手段相对滞后，生产上大面积推广的主栽品种仍主要依赖日本、韩国及欧美等发达国家和地区进口。因此，迫切需要开展胡萝卜分子育种技术研究，加速突破性品种的选育，为胡萝卜产业的自主可持续发展提供技术支撑。

2、随着胡萝卜全基因组精细图谱的绘制完成，目前已获得近千份代表性胡萝卜种质的高密度基因组变异数据，并成功定位了调控根形、根色、类胡萝卜素积累、抗病性及抽薹性等多个重要农艺性状的关键功能基因，为开展胡萝卜分子育种奠定基础。液相育种芯片是一种融合高通量测序与液相杂交捕获的新型分子标记检测技术，兼具高灵活性、高数据质量和低成本优势，既能满足大规模群体遗传筛查的需求，也适用于小批量育种材料的精细解析。目前，液相芯片技术已在玉米、水稻、小麦及番茄等作物的种质资源评价、分子标记辅助回交、全基因组关联分析、品种dna指纹构建及纯度鉴定等领域得到广泛应用。然而，针对胡萝卜品种dna指纹鉴别及全基因组选择育种等场景的特异性液相芯片产品尚属空白。因此，研制一款覆盖胡萝卜关键功能基因和全基因组代表性snp标记的高效育种液相芯片，对于加速胡萝卜遗传改良、缩短育种周期、保护品种知识产权及推动我国胡萝卜种业自主创新具有十分重要的现实意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种胡萝卜全基因组5k 液相育种芯片及其专用探针组合和应用。该液相育种芯片可以精准、高效、特异、互不干扰、稳定地获得胡萝卜全基因组5237个单核苷酸多态性变异位点的基因型。5237个单核苷酸多态性变异位点具有多态性高、在染色体上均匀分布、标记稳定可靠等特点。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明第一方面提供一种用于检测胡萝卜全基因组单核苷酸多态性变异位点（snp位点）组合的探针组合，每个单核苷酸多态性变异位点对应一个探针，所述单核苷酸多态性变异位点组合包括5237个单核苷酸多态性变异位点，所述5237个单核苷酸多态性变异位点在胡萝卜基因组中的位置和碱基类型如本发明说明书表1所示的，5237个单核苷酸多态性变异位点在基因组中的位置是基于胡萝卜dh1 v3参考基因组确定的，表1中，每个单核苷酸多态性变异位点的信息中，左侧的数字表示单核苷酸多态性变异位点所在的染色体编号，中间的数值表示单核苷酸多态性变异位点所在的染色体的物理位置，右侧字母表示单核苷酸多态性变异位点的两种碱基类型。

4、在本发明第一方面的探针组合中，作为一种优选实施方式，所述探针组合中各个探针的核苷酸序列在基因组中的对应位置如本发明说明书表2所示，每个探针对应位置的信息中包含三个数据，自左向右，第一个数据代表单核苷酸多态性变异位点所在染色体编号，第二个数据代表探针所在染色体上的起始位置，第三个数据代表探针所在染色体上的终止位置；所述每个探针在基因组中的对应位置是基于胡萝卜dh1 v3参考基因组确定的。

5、本发明第二方面提供一种胡萝卜全基因组5k 液相育种芯片，其包括本发明第一方面所述的用于检测胡萝卜全基因组单核苷酸多态性变异位点组合的探针组合。

6、该胡萝卜全基因组5k液相育种芯片靶向第一方面中所述用于检测胡萝卜全基因组单核苷酸多态性变异位点，以获取多态性位点的碱基信息或多态性位点的基因分型。

7、液相育种芯片中还可以包含常用的其它所需试剂或设备。

8、本发明第三方面提供上述第一方面的用于检测胡萝卜全基因组单核苷酸多态性变异位点组合的探针组合的用途，所述用途包括如下（1）至（7）中的任一种：

9、（1）用于制备鉴定胡萝卜品种的试剂盒；

10、（2）用于制备鉴别胡萝卜品种真伪性的试剂盒；

11、（3）用于制备分析胡萝卜品种的遗传亲缘关系的试剂盒；

12、（4）用于鉴定胡萝卜品种；

13、（5）用于鉴别胡萝卜品种真伪性；

14、（6）用于分析胡萝卜品种的遗传亲缘关系；

15、（7）用于构建待测胡萝卜品种的指纹图谱数据库。

16、本发明第四方面提供上述第二方面的胡萝卜全基因组5k 液相育种芯片的用途，所述用途包括如下（a）至（d）中的任一种；

17、（a）用于鉴定胡萝卜品种；

18、（b）用于鉴别胡萝卜品种真伪性；

19、（c）用于分析胡萝卜品种的遗传亲缘关系；

20、（d）用于构建待测胡萝卜品种的指纹图谱数据库。

21、本发明第五方面提供一种供试胡萝卜品种指纹图谱数据库的构建方法，包括如下步骤：

22、s1-1: 获取供试胡萝卜品种的基因组dna；

23、s1-2: 步骤s1-1得到的基因组dna经破碎、末端修复、接头连接以及纯化获得dna文库；

24、s1-3: 将dna文库与上述第一方面的探针组合形成杂交体系并进行杂交捕获，经纯化得到测序文库；

25、s1-4: 对测序文库进行测序以及数据分析从而获得本发明说明书表1所示的5237个单核苷酸多态性变异位点的基因分型信息，根据5237个单核苷酸多态性变异位点的基因分型信息构建供试胡萝卜品种指纹图谱数据库。

26、本发明第六方面提供一种待测胡萝卜品种的鉴定方法，包括如下步骤：

27、s2-1: 分别获取待测胡萝卜品种和标准胡萝卜品种的基因组dna；

28、s2-2: 步骤s2-1得到的各个品种基因组dna经破碎、末端修复、接头连接以及纯化获得相应品种的dna文库；

29、s2-3:将各个品种的dna文库分别与上述第一方面的探针组合形成杂交体系并进行杂交捕获，经纯化得到各个品种的测序文库；

30、s2-4: 对各个品种的测序文库进行测序以及数据分析从而获得各个品种中本发明说明书表1所示的5237个单核苷酸多态性变异位点的基因分型信息；

31、s2-5:将待测胡萝卜品种的5237个单核苷酸多态性变异位点的基因分型结果分别与标准胡萝卜品种的5237个单核苷酸多态性变异位点的基因分型结果进行对比，统计两个胡萝卜品种的单核苷酸多态性变异位点相似度ls，ls的计算公式为：ls = (1-d/t)×100%，其中d为比较的两个品种间的差异单核苷酸多态性变异位点数，t为比较的总单核苷酸多态性变异位点数；然后进行如下判断：

32、如果待测胡萝卜品种与某标准胡萝卜品种的位点相似度≥98.0%，则待测胡萝卜品种和该标准胡萝卜品种为同一品种或疑似为同一品种；差异位点数越少，品种相似度越高；

33、如果待测胡萝卜品种与某标准胡萝卜品种的位点相似度在95.0%~98.0%之间且不包含98%，则待测胡萝卜品种和该标准胡萝卜品种为近似品种；

34、如果待测胡萝卜品种与某标准胡萝卜品种的位点相似度＜95.0%，则待测胡萝卜品种和该标准胡萝卜品种为不同品种。

35、本发明中所述的标准胡萝卜品种是指已知的胡萝卜品种，比如本发明表3中记录的190个胡萝卜品种。

36、上述第五方面的供试胡萝卜品种指纹图谱数据库的构建方法或上述第六方面的待测胡萝卜品种的鉴定方法中，作为一种可实施方式，步骤s1-2或s2-2中，所述破碎、末端修复是通过含有片段化及末端修复酶的体系来完成的，所述体系为：300ng dna，片段化及末端修复酶2.6 μl，末端修复反应缓冲液4 μl，超纯水补足体系至20 μl。

37、上述第五方面的供试胡萝卜品种指纹图谱数据库的构建方法或上述第六方面的待测胡萝卜品种的鉴定方法中，作为一种可实施方式，步骤s1-2或s2-2中，所述接头连接的反应体系为末端修复后的dna 10 ng，dna连接酶2μl，缓冲液8μl，illumina trueseq通用接头序列4μl，超纯水补足至20μl。

38、上述第五方面的供试胡萝卜品种指纹图谱数据库的构建方法或上述第六方面的待测胡萝卜品种的鉴定方法中，作为一种可实施方式，步骤s1-3或s2-3中，所述杂交体系为浓缩后的步骤s1-2或步骤s2-2得到的dna文库2.5μg，4 μl浓度为50ng/μl的探针工作液，超纯水补足体系至16 μl。

39、本发明的有益效果：

40、（1）本发明提供的单核苷酸多态性变异位点组合具有多态性高、重复性好、在染色体上均匀分布、标记稳定可靠和便于统计等优点，能最大限准确地反映供试胡萝卜品种的遗传亲缘关系。

41、（2）本发明液相育种芯片所涉及的单核苷酸多态性变异位点组合的材料背景涵盖了更为广泛的胡萝卜品种，代表性高，多样性信息丰富。

42、（3）本发明提供的探针组合能够精准、高效、特异、互不干扰、稳定地获得胡萝卜全基因组5237个单核苷酸多态性变异位点的基因型。

43、（4）本发明提供的5k液相育种芯片可应用于胡萝卜品种真实性鉴定、亲缘关系鉴定、杂交选育和指纹图谱构建，有利于加快胡萝卜研究及育种的进程。

44、（5）本发明首次提供了基于高通量测序构建用于鉴定胡萝卜品种真实性的dna指纹数据库的方法，可用于对胡萝卜品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益，并为胡萝卜种质资源和新品种保护提供技术支持。

45、（6）本发明提供的鉴定胡萝卜品种的方法既可以对未知胡萝卜品种进行鉴定，也可以对已知品种的真实性进行鉴定。

46、（7）本发明提供的胡萝卜品种鉴定方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。