一种G型产气荚膜梭菌多表位抗原肽及其在制备疫苗中的应用

本发明属于生物技术与兽用疫苗领域，具体涉一种g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽及其在制备疫苗中的应用。

背景技术：

1、产气荚膜梭菌（clostridium perfringens）是一种革兰氏阳性、厌氧产芽孢的条件致病菌，广泛存在于土壤、水源及动物胃肠道中。其中，g型产气荚膜梭菌因其分泌的netb毒素，已成为诱发禽坏死性肠炎（necrotic enteritis, ne）的主要病原体。该病以肠道黏膜坏死、饲料转化率下降及高死亡率为特征，2-6周龄肉鸡最为易感，每年对全球养禽业造成高达数十亿美元的经济损失。

2、传统上，该病的防控主要依赖在饲料中添加亚治疗剂量的抗生素。然而，随着抗生素耐药性传播及药物残留问题日益受到重视，全球范围内逐步推行饲料禁抗政策。在此背景下，坏死性肠炎的发病率在多个国家和地区显著回升，开发安全高效的替代疫苗已成为产业界的迫切需求。

3、目前，针对坏死性肠炎的商业疫苗极为有限。早期基于a型菌株开发的类毒素疫苗（如netvax）因缺乏netb等关键毒力因子保护效力不足，已停止生产。近年来报道的活载体疫苗（如avertne）虽可递送netb和α毒素抗原，但存在生物安全顾虑，且上市区域有限。传统灭活疫苗和类毒素疫苗主要存在以下问题：一是免疫原性单一，难以覆盖多种毒力因子；二是非必需成分可能诱发超敏反应；三是体外培养的菌株难以产生足量的关键毒力蛋白，导致免疫保护效果不佳。

4、产气荚膜梭菌感染可诱发人和多种动物的肠毒血症、坏死性肠炎及气性坏疽，病程进展迅速，常在短时间内导致休克或死亡，临床干预难度较高。因此，疫苗接种仍是防控该类疾病的核心策略。然而，传统类毒素疫苗在生产工艺、免疫保护效力及安全性方面存在固有局限，难以完全满足当前养殖业对高效疫苗的迫切需求，新型疫苗的研发已成为该领域的研究热点。随着结构疫苗学和免疫信息学的发展，多表位疫苗（mev）已成为新一代疫苗研发的重要方向。多表位疫苗仅包含病原体保护性抗原的优势b细胞表位和t细胞表位，可同时靶向多个毒力相关因子，剔除潜在致敏性片段，具有安全性高、免疫靶点明确、可同时激活体液免疫和细胞免疫等优势。然而，目前针对产气荚膜梭菌坏死性肠炎的多表位疫苗研究尚处于起步阶段，缺乏将毒素结构域、关键毒力因子与代谢酶等多种功能互补抗原整合至同一分子中的设计策略。

技术实现思路

1、发明目的：本发明针对传统产气荚膜梭菌疫苗存在的免疫原性单一、保护效力有限、存在潜在安全风险等问题，提供一种基于免疫信息学技术设计的多表位串联抗原肽，及其在制备疫苗中的应用。

2、技术方案：为解决上述技术问题，本发明所述一种g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽，其氨基酸序列如seq id no:5所示。

3、本发明所述编码上述的g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽的基因，基因的核苷酸序列如如seq id no.4。

4、本发明所述包含上述g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽的重组表达载体。

5、进一步地，所述重组载体通过将seq id no:4所示的片段连接到基础载体中获得，所述片段的5’端和3’端分别添加

sal i和

ecor i酶切位点。

6、进一步地，所述基础载体为pet28a。

7、本发明所述包含上述g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽的宿主细胞。

8、进一步地，所述宿主细胞所用的工程菌为大肠杆菌bl21。

9、本发明所述的g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽、所述的重组表达载体、或所述的宿主细胞在制备g型产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎疫苗中的应用。

10、进一步地，所述疫苗还含有药学上可接受的佐剂。

11、本发明选取产气荚膜梭菌三种功能互补的免疫原性蛋白作为抗原靶点，采用免疫信息学技术对上述三种靶蛋白进行表位预测与筛选，得到一种具有免疫保护作用的npf蛋白。利用原核表达方法制备得到重组npf蛋白，使用动物实验评估其免疫保护力。结果证明npf蛋白作为亚单位疫苗免疫动物可显著降低g型产气荚膜梭菌攻毒后引起的临床症状，具有作为疫苗的潜力。

12、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本申请的g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽制备的疫苗可显著降低临床症状；能诱导机体产生高效的体液免疫应答；抗原靶点覆盖全面，免疫应答更广谱；安全性高，仅保留具有高抗原性、高保守性且无毒、无致敏性的优势表位，剔除了非必需抗原成分。

1.一种g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:5所示。

2.编码根据权利要求1所述的g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽的基因，其特征在于，基因的核苷酸序列如seq id no:4。

3.包含权利要求1所述g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组载体通过将seq id no:4所示的片段连接到基础载体中获得，所述片段的5’端和3’端分别添加sal i和ecor i酶切位点。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述基础载体为pet28a。

6.包含权利要求1所述g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽的宿主细胞。

7.根据权利要求6宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞所用的工程菌为大肠杆菌bl21。

8.权利要求1所述的g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽、权利要求3~5任一项所述的重组表达载体、或权利要求 6~7任一项所述的宿主细胞在制备g型产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎疫苗中的应用。

9.一种坏死性肠炎疫苗，其特征在于，其含有权利要求1所述的g型产气荚膜梭菌多表位抗原肽。

10.根据权利要求9所述的坏死性肠炎疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含药学上可接受的佐剂。