一种枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）GH1及其应用的制作方法

背景技术：

1、心脑血管疾病是当前全球范围内威胁人类健康与生命的主要疾病之一。《中国心血管健康与疾病报告2024》显示，我国心血管疾病患病人数高达3.3亿，其中高血压患者2.45亿，冠心病、卒中患者均超千万；心血管疾病导致的死亡占居民总死亡近50%，高居各类疾病首位。面对如此严峻的防控形势，积极探索安全有效的功能性食品及活性成分成为心脑血管疾病防治策略中的重要方向。

2、川芎嗪作为一种生物活性生物碱，具有扩张血管、抑制血小板积聚及改善微循环等功效。同时，溶纤酶是一类能够直接降解纤维蛋白的蛋白酶，可有效溶解血栓，在心脑血管疾病的预防和治疗中发挥着关键作用。两者在作用溶栓抗栓机制上具有互补性，即川芎嗪侧重于改善血液循环、抑制血小板聚集，溶纤酶则直接作用于纤维蛋白降解血栓，二者协同可更全面地发挥心脑血管保护功能。芽孢杆菌属（

bacillus）是发酵食品中常见的优势微生物类群，具有良好的食品安全性和代谢活性物质的能力。课题组前期研究发现，

b.

subtilis bj3-2发酵薏米可富集川芎嗪和溶纤酶。可见，

b. subtilis是生产川芎嗪和溶纤酶的优良微生物资源。目前能够同时高产川芎嗪和溶纤酶的双功能芽孢杆菌菌株报道仍较为匮乏，尤其是同一菌株在同一发酵体系中协同积累两种活性成分的系统研究尚不多见。

3、近年来，发酵食品及其功能活性成分受到广泛关注，大健康食品在慢性疾病防治中的应用正成为食品科学研究的前沿热点。因此，研发富含川芎嗪和溶纤酶双重功效成分的功能性发酵食品，具有重要的理论价值和广阔的应用前景。

4、此外，血栓形成也与肠道健康密切相关。研究表明，肠道菌群种类失衡，会导致厚壁菌门/拟杆菌门比例升高，促炎菌群增加等，从而导致肠道局部炎症反应和通透性增加，触发机体产生低度全身性炎症反应，进而促进血栓的形成。但是，当前预防血栓形成的保健品或功能性食品主要针对心血管单一靶点，忽视肠道菌群与血栓风险的关联。

技术实现思路

1、为解决目前同一菌株在同一发酵体系中协同积累川芎嗪和溶纤酶两种活性成分的系统研究尚不多见的问题，且缺乏“肠-血栓”的大健康天然食品。本发明筛选获得1株高产川芎嗪和高产溶纤酶的芽孢杆菌菌株，该菌株在具有高溶纤酶活性的同时，具备高产川芎嗪能力，并利用该菌株发酵薏米，构建了一种协同高产川芎嗪和溶纤酶的标准化发酵薏米的方法以及制作固态饮品的方法。

2、具体是通过以下技术方案予以实现：

3、第一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌（

bacillus subtilis）gh1，所述枯草芽孢杆菌gh1已于2026年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.38585。

4、所述枯草芽孢杆菌gh1分离源自发酵豆豉。

5、所述枯草芽孢杆菌gh1于37℃在lb琼脂培养基上生长，菌落形态圆形，呈微黄色、表面干燥、不透明，形状不规则、边缘不齐整；其革兰氏染色试验呈阳性（+），显微镜下观察其菌体为杆状；硫化氢试验为阳性、吲哚试验以及硝酸盐还原试验均为阴性。

6、第二发明，本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌gh1在提高薏米发酵物中活性成分含量中的应用，所述活性成分为川芎嗪、溶纤酶、γ-氨基丁酸、薏苡素、多酚、黄酮、三萜和薏苡酯中的至少一种。

7、以及，所述的枯草芽孢杆菌gh1在富集川芎嗪和溶纤酶中的应用。

8、第三方面，本发明提供了一种发酵薏米制品的制备方法，包括以下步骤：

9、（1）菌种活化：将保藏编号为cgmcc no. 38585的枯草芽孢杆菌gh1进行活化、纯检合格后斜面培养，备用；

10、（2）种子液制备：将枯草芽孢杆菌gh1接种于lb肉汤培养基，摇瓶培养，获得悬菌液，然后经离心分离，沉淀出菌体并用生理盐水洗涤至菌液浓度为1.0×108cfu/ml ~ 1.8×108cfu/ml，即得种子液；

11、所述摇瓶培养的条件：培养温度为37 ℃，摇瓶转速为180 r/min，培养时间为24h；所述离心分离的条件：转速为10000 rpm，时间为5 min；

12、（3）固态发酵：将洗净的薏米浸泡一夜后，加入超纯水灭菌，然后按照接种量（v/m）为薏米质量5%-9%的比例，将步骤（2）所得的种子液接种于灭菌后的薏米中，混匀后，于34℃-40 ℃条件下固态发酵72-96 h，得到发酵产物；

13、所述灭菌的条件：时间为15 ~ 35 min，优选为30 min；料水比（m/v）为1:（1.4 ~1.8），优选为1：1.6；

14、优选地，所述固态发酵的条件：接种量（v/m）为7%，发酵温度为37℃，发酵时间为87h；

15、（4）冻干粉制作：向发酵产物中加入抗坏血酸并混合均匀，然后依次经冷冻干燥、粉碎、过40目筛，即得发酵薏米冻干粉，并于4℃下密封冷藏备用。

16、所述抗坏血酸的添加量为所述发酵产物质量的0.1%~1.0%。

17、所述冷冻干燥是指先将混合有抗坏血酸的发酵产物置于-80 ℃预冻4 ~ 8 h，然后在冷阱温度为-50℃至-40℃、真空度为2 ~ 5 pa的条件下干燥36 ~ 60h。

18、优选地，所述冷冻干燥是指将混合有抗坏血酸的发酵产物分装于培养皿中，厚度为9 mm，先置于-80℃预冻6h，然后在冷阱温度为-50℃、真空度为3 pa的条件下干燥48h。

19、第四方面，本发明提供了一种发酵薏米固体饮料，是将发酵薏米冻干粉、益生菌粉混合，加入粘合剂，经挤压造粒，获得发酵薏米固态饮料；所述发酵薏米冻干粉为保藏编号cgmcc no. 38585的枯草芽孢杆菌gh1对薏米进行固态发酵后、再与抗坏血酸混合并冷冻干燥得到的粉体。

20、所述粘合剂为麦芽糊精，所述麦芽糊精的添加占所述发酵薏米固体饮料总质量的15%~20%。

21、所述发酵薏米粉与所述益生菌粉的质量比为(3~7):（7~3），优选地为7:3。

22、有益效果

23、1、本发明提供了一株枯草芽孢杆菌gh1（cgmcc no.38585），其硫化氢试验、吲哚试验及硝酸盐还原试验均为阴性，安全性高，适宜用于功能性食品发酵。该菌株具有高溶纤酶酶活及高产川芎嗪的双重功能，发酵薏米时溶纤酶酶活达1437.195 u/g，乙偶姻产量达10.433 mg/g，川芎嗪产量达1.32 mg/g，显著优于已报道的枯草芽孢杆菌bj3-2。

24、2、本发明通过单因素与响应面法优化了枯草芽孢杆菌gh1发酵薏米的工艺参数，最优条件为：接种量7%、料水比1:1.6、发酵温度37℃、发酵时间87h。在该条件下，发酵薏米中溶纤酶酶活高达2088.28 u/g，川芎嗪产量达4.10 mg/g dw，实现了同一菌株在同一发酵体系中协同高产两种活性成分。

25、3、本发明的发酵薏米产物中活性物质含量显著提升。其中，γ-氨基丁酸含量为6.21 mg/g，是未发酵薏米的310.5倍。薏苡素含量为7.54 μg/g，是未发酵薏米的4.31倍。多酚和黄酮含量分别为2.37mg gae/g和3.32mg re/g，是未发酵薏米的8.78和6.64倍。此外，三萜和薏苡酯含量均显著提高。这一方面得益于枯草芽孢杆菌gh1具备良好的发酵特点，另一方面得益于在冷冻干燥过程中添加抗坏血酸（vc）作为保护剂，显著提升了活性物质的稳定性，尤其是溶纤酶和川芎嗪。添加抗坏血酸的冻干薏米粉中溶纤酶酶活为6781.59~8254.33 u/g dw，较未添加组增加了23% ~ 40%；其川芎嗪含量为3.27 ~ 3.74 mg/g dw，较未添加组增加了0.22%~16.9%。在-20℃贮藏4周后，酶活保留率仍高达93%以上，有效解决了活性成分在加工与保藏过程中易失活的问题。

26、4、本发明将发酵薏米冻干粉与益生菌粉复配，并添加15%~20%麦芽糊精制备固态饮品。该饮品在体外溶栓实验中表现出极强的纤维蛋白降解能力，3:7（益生菌粉:发酵薏米冻干粉）配比组在9h时血栓剩余率仅4.08%，与尿激酶阳性对照组相当；同时，该配比组对cox-2的抑制率达83.42%，具有显著的抗炎活性；dpph自由基清除率达94.81%，abts清除率达99.47%，兼具良好的抗氧化能力。

27、5、本发明制备的固态饮品在体外模拟消化中表现出优异的川芎嗪释放与溶纤酶胃肠稳定性。3:7配比组在肠消化末期川芎嗪含量仍达1.50 mg/g dw，溶纤酶活性保留至1304.22 u/g，仍具备显著的溶栓功效。产品基本营养成分丰富，且通过添加罗伊氏乳杆菌冻干粉有效调节了产品的味觉特征，降低了苦味回味与涩味回味。