一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺的制作方法

本发明涉及多肽制备，更具体地涉及一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺。

背景技术：

1、胎盘中含有丰富的蛋白质、多肽、氨基酸、激素、细胞因子及核酸等生物活性物质，具有免疫调节、抗氧化、抗衰老等多种生理功能，从胎盘中提取多肽类活性成分，是开发生物活性制品的重要途径；

2、目前，胎盘多肽的制备方法主要包括酸水解法、碱水解法和酶解法等，其中，酶解法因反应条件温和、产物活性保留好、安全性高等优点，成为研究热点，但是现如今的胎盘多肽冻干粉制备工艺存在以下问题：

3、现有胎盘多肽制备时，在进行胎盘的细胞破壁时，破壁效率低，从而使得冻融次数多，生产周期长，进而降低整体的生产效率；现有分步酶解工艺中采用加热灭酶进行步骤切换导致多肽活性损失，且游离酶无法回收利用、成本高；现有胎盘多肽产物中抗氧化活性肽段纯度低、分子量分布分散，冻干过程导致活性损失严重。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施条例提供一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，以解决背景技术中所提出的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，包括以下步骤：

3、步骤s1、原料预处理，将动物胎盘去除筋膜和血管，清洗后剪碎，加入生理盐水或去离子水进行匀浆，得胎盘匀浆液；

4、步骤s2、破碎预处理，将胎盘匀浆液依次进行超声处理以及高压微射流均质处理；

5、步骤s3、反复冻融破壁，将步骤s2破碎预处理后的胎盘匀浆在-20℃至-40℃、冷冻12-24小时，解冻后反复冻融2-4次；

6、步骤s4、固定化酶分步酶解，将磁性纳米载体固定化胰蛋白酶加入步骤s3所得冻融后的胎盘匀浆液中进行第一段酶解，酶解结束后通过外加磁场分离回收固定化胰蛋白酶，将磁性纳米载体固定化中性蛋白酶和风味蛋白酶的复合酶加入回收的酶解液中进行第二段酶解；

7、步骤s5、离心与膜分离，将步骤s4处理后的酶解液离心，收集上清液，依次通过微滤膜和超滤膜进行过滤，收集超滤透过液；

8、步骤s6、层析富集，将步骤s5所得超滤透过液通过大孔吸附树脂柱进行层析分离，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，得胎盘多肽浓缩液；

9、步骤s7、添加冻干保护剂，向步骤s6所得胎盘多肽浓缩液中加入冻干保护剂；

10、步骤s8、冷冻干燥，将步骤s7所得的浓缩液进行冷冻干燥，得胎盘多肽冻干粉。

11、在一个优选的实施方式中，所述步骤s1中，动物胎盘为羊胎盘、人胎盘、牛胎盘以及驼胎盘中的任意一种，步骤s1中，匀浆在4-10℃条件下进行，清洗采用0.9％生理盐水反复清洗2-4次，剪碎至0.5cm-2cm×0.5cm-2cm的小块。

12、在一个优选的实施方式中，所述步骤s2中，破碎预处理时，先将胎盘匀浆液在超声功率200-500w、频率20-40khz条件下超声处理10-30分钟，再于100-200mpa压力下进行高压微射流均质处理，循环2-4次。

13、在一个优选的实施方式中，所述步骤s4中，所述第一段酶解的酶解条件为：ph7.0-8.5，酶解温度为35-45℃，酶解时间为2-6小时，磁性纳米载体固定化胰蛋白酶的添加量以胰蛋白酶计为底物蛋白质量的1％-5％；第二段酶解的酶解条件为：ph6.0-7.5，酶解温度为45-55℃，酶解时间为2-4小时，磁性纳米载体固定化复合酶中中性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1-2:1，总添加量以复合酶计为底物蛋白质量的1％-4％。

14、在一个优选的实施方式中，所述步骤s4中，磁性纳米载体固定化胰蛋白酶以及磁性纳米载体固定化复合酶，采用共沉淀法制备fe3o4磁性纳米粒子，经sio2包覆和戊二醛活化后，分别与胰蛋白酶溶液、中性蛋白酶以及风味蛋白酶的混合酶溶液在4℃下固定化12-24小时制备，第一段酶解和第二段酶解结束后通过外加磁场分离回收固定化复合酶。

15、在一个优选的实施方式中，所述步骤s5中，离心转速为10000rpm、离心时间为15-30分钟，微滤膜孔径为0.22-0.45μm、超滤膜截留分子量为3-10kda。

16、在一个优选的实施方式中，所述步骤s6中，大孔吸附树脂为da201-c型树脂，乙醇洗脱液的体积分数为10％-30％，减压浓缩的温度为40-50℃，浓缩至原体积的1/10-1/5。

17、在一个优选的实施方式中，所述步骤s7中，冻干保护剂为甘露醇和海藻糖按质量比1:1的混合物，总添加量为浓缩液质量的5％。

18、在一个优选的实施方式中，所述步骤s8中，冷冻干燥过程为：在-40℃至-50℃预冻4-8小时，在-25℃至-15℃、真空度10-30pa下一次干燥12-24小时，在20-30℃、真空度5-15pa下二次干燥4-8小时。

19、在一个优选的实施方式中，步骤s8中，制得的多肽冻干粉中，多肽含量≥65％，80％以上的肽段分子量在500-3000da之间，dpph自由基清除率≥75％，abts自由基清除率≥70％，含水量≤3％，其中dpph自由基清除率和abts自由基清除率的测试浓度均为1mg/ml。

20、本发明的技术效果和优点：

21、1、本发明通过将超声处理与高压微射流均质处理依次组合形成破碎预处理，再与反复冻融形成“超声-高压微射流均质-冻融”的三级递进式协同破壁体系，三者依次作用、层层递进，在保证破壁效果的同时减少冻融次数，进而缩短工艺周期，提高胎盘多肽冻干粉的生产效率；

22、2、本发明通过采用磁性纳米载体将胰蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶分别固定化，通过外加磁场即可实现固定化酶的快速分离回收和步骤间的精确切换，避免加热灭酶对多肽活性的热损伤，实现酶的重复利用，进而降低生产成本；

23、3、本发明通过da201-c型大孔吸附树脂层析富集和甘露醇/海藻糖冻干保护剂的协同作用，实现抗氧化活性肽段的定向富集和活性构象的有效保护，产物中8的肽段分子量集中在500-3000da之间，多肽含量更高，引出在提高产物纯度和抗氧化活性的同时确保产品的长期储存稳定性。

1.一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，其特征在于：所述步骤s1中，动物胎盘为羊胎盘、人胎盘、牛胎盘以及驼胎盘中的任意一种，步骤s1中，匀浆在4-10℃条件下进行，清洗采用0.9％生理盐水反复清洗2-4次，剪碎至0.5cm-2cm×0.5cm-2cm的小块。

3.根据权利要求1所述的一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，其特征在于：所述步骤s2中，破碎预处理时，先将胎盘匀浆液在超声功率200-500w、频率20-40khz条件下超声处理10-30分钟，再于100-200mpa压力下进行高压微射流均质处理，循环2-4次。

4.根据权利要求1所述的一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，其特征在于：所述步骤s4中，所述第一段酶解的酶解条件为：ph7.0-8.5，酶解温度为35-45℃，酶解时间为2-6小时，磁性纳米载体固定化胰蛋白酶的添加量以胰蛋白酶计为底物蛋白质量的1％-5％；第二段酶解的酶解条件为：ph6.0-7.5，酶解温度为45-55℃，酶解时间为2-4小时，磁性纳米载体固定化复合酶中中性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1-2:1，总添加量以复合酶计为底物蛋白质量的1％-4％。

5.根据权利要求4所述的一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，其特征在于：所述步骤s4中，磁性纳米载体固定化胰蛋白酶以及磁性纳米载体固定化复合酶，采用共沉淀法制备fe3o4磁性纳米粒子，经sio2包覆和戊二醛活化后，分别与胰蛋白酶溶液、中性蛋白酶以及风味蛋白酶的混合酶溶液在4℃下固定化12-24小时制备，第一段酶解和第二段酶解结束后通过外加磁场分离回收固定化复合酶。

6.根据权利要求1所述的一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，其特征在于：所述步骤s5中，离心转速为10000rpm、离心时间为15-30分钟，微滤膜孔径为0.22-0.45μm、超滤膜截留分子量为3-10kda。

7.根据权利要求1所述的一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，其特征在于：所述步骤s6中，大孔吸附树脂为da201-c型树脂，乙醇洗脱液的体积分数为10％-30％，减压浓缩的温度为40-50℃，浓缩至原体积的1/10-1/5。

8.根据权利要求1所述的一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，其特征在于：所述步骤s7中，冻干保护剂为甘露醇和海藻糖按质量比1:1的混合物，总添加量为浓缩液质量的5％。

9.根据权利要求1所述的一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，其特征在于：所述步骤s8中，冷冻干燥过程为：在-40℃至-50℃预冻4-8小时，在-25℃至-15℃、真空度10-30pa下一次干燥12-24小时，在20-30℃、真空度5-15pa下二次干燥4-8小时。

10.根据权利要求1所述的一种采用酶解法的胎盘多肽冻干粉制备工艺，其特征在于：步骤s8中，制得的多肽冻干粉中，多肽含量≥65％，80％以上的肽段分子量在500-3000da之间，dpph自由基清除率≥75％，abts自由基清除率≥70％，含水量≤3％，其中dpph自由基清除率和abts自由基清除率的测试浓度均为1mg/ml。