一种生产表面活性素且不产芽孢的芽孢杆菌及其应用的制作方法
本技术涉及合成生物学，尤其涉及一种生产表面活性素且不产芽孢的芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
1、表面活性素（surfactin）是由枯草芽孢杆菌等微生物产生的一种环状脂肽类生物表面活性剂，其核心优势在于卓越的理化性能、生物安全性、环境相容性以及多重生物活性功能。表面活性素是目前最受关注的生物表面活性剂之一，在化妆品、食品、医疗、农业、石油开采、环境治理等领域都有广泛的应用前景，但是实现其产业化应用面临的主要瓶颈之一就是发酵产量低和生产成本高的问题。
2、目前提高表面活性素发酵产量的方法不再局限于野生菌株发酵工艺优化、诱变筛选等手段，随着表面活性素合成研究的不断深入以及生物技术的持续进步，枯草芽孢基因工程菌的构建成为提高发酵产量的重要手段。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明旨在提供一个高效生产表面活性素并且不产生芽孢的重组工程菌株，可用于表面活性素的工业化生产。
2、一方面，本技术提供了一种生产表面活性素且不产芽孢的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌包括如下a1）-a2）任一种或两种改造：
3、a1）调控芽孢合成相关基因
spoivb不表达和/或低表达；
4、a2）表达和/或过表达4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶，所述4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶包含如seq id no.3所示氨基酸序列或与seq id no.3具有至少95％同一性的氨基酸序列。
5、优选的，所述4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶包含如seq id no.3所示氨基酸序列或与seq id no.3具有95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性的氨基酸序列。
6、进一步地，编码所述4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶的核苷酸序列包含如seq idno.2所示序列或与seq id no.2具有至少80％同一性的核苷酸序列。
7、优选的，编码所述4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶的核苷酸序列包含如seq id no.2所示序列或与seq id no.2具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性的核苷酸序列。
8、所述编码所述4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶的基因为
sfpth。
9、进一步地，所述过表达通过强启动子表达4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶实现。
10、优选的，所述强启动子包括强诱导性启动子，更优选的，所述强诱导性启动子为启动子
pgrac，更优选的，所述启动子
pgrac序列如seq id no.1所示。
11、进一步地，所述4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶表达和/或过表达可为游离表达或整合表达。
12、更优选的，整合表达。
13、本领域技术人员可根据实际情况选择整合位点和整合方法，只要能够实现目的基因的表达即可，在此不做强制限定。
14、更优选的，将编码4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶的基因插入到
spoivb基因位点，实现整合表达。
15、更优选的，利用基于pjoe8999质粒构建的基因编辑质粒实现4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶的整合表达。
16、进一步地，所述调控芽孢合成相关基因
spoivb不表达和/或弱表达的方法包括：减弱或沉默所述调控芽孢合成相关基因
spoivb的表达，和/或导入能够敲除所述调控芽孢合成相关基因
spoivb的物质。
17、所述不表达也可以包括不含有对应基因，并且，所述弱表达或者不表达也可通过敲除和/或沉默和/或抑制蛋白质的编码基因的表达或导入能够敲除或降低芽孢杆菌基因组中所述蛋白质的编码基因的表达的物质实现，只要能够实现蛋白质的不表达、低表达、抑制表达或抑制其活性即可。
18、优选的，所述弱表达或者不表达通过敲除实现。
19、本领域技术人员可根据实际情况选择敲除方法，本技术中不做具体限制。
20、更优选的，通过构建靶向芽孢合成相关基因
spoivb的打靶元件实现基因的敲除。
21、更可选的，所述打靶元件包括芽孢合成相关基因
spoivb的上游同源臂、芽孢合成相关基因
spoivb的下游同源臂。
22、更可选地，还包括靶向芽孢合成相关基因
spoivb的sgrna序列，sgrna序列引物如p1和p2所示。
23、更优选的，利用基于pjoe8999质粒的基因编辑系统实现芽孢合成相关基因
spoivb的敲除。
24、在一种优选的实施方式中，将靶向芽孢合成相关基因
spoivb的sgrna与打靶元件连接到pjoe8999质粒，构建敲除质粒，并将敲除质粒转入芽孢杆菌中，可实现芽孢合成相关基因
spoivb的敲除。
25、进一步地，所述调控芽孢合成相关基因
spoivb包含如seq id no.5所示氨基酸序列或与seq id no.5具有至少95％同一性的氨基酸序列。
26、优选的，所述调控芽孢合成相关基因
spoivb包含如seq id no.5所示氨基酸序列或与seq id no.5具有95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性的氨基酸序列。
27、进一步地，所述调控芽孢合成相关基因
spoivb包含如seq id no.4所示核苷酸序列或与seq id no.4具有至少85％同一性的核苷酸序列。
28、优选的，所述调控芽孢合成相关基因
spoivb包含如seq id no.4所示核苷酸序列或与seq id no.4具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性的核苷酸序列。
29、本领域技术人员可采用已知的基因编辑工具或基因编辑方法完成上述改造操作，在本技术中不作具体限定。
30、在一种优选的实施方式中，将靶向芽孢合成相关基因
spoivb的sgrna与打靶元件和编码4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶的基因连接到pjoe8999质粒，构建基因编辑质粒，并将基因编辑质粒转入芽孢杆菌中，可实现芽孢合成相关基因
spoivb的敲除和4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶基因的同步整合。
31、更优选的，所述基因编辑质粒中包含sgrna，和依次连接的芽孢合成相关基因
spoivb的上游同源臂、启动子
pgrac、编码4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶的基因、芽孢合成相关基因
spoivb的下游同源臂。
32、进一步地，所述的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中的任一种及以上。
33、优选的，所述的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌。
34、更优选的，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（
bacillus subtilis）168。
35、本技术方案适合所有芽孢杆菌底盘的菌株，在此不做进一步限定。
36、另一方面，本技术还提供了一种表面活性素的制备方法，所述制备方法包括：培养所述的芽孢杆菌。
37、本领域技术人员可采用常规方式培养芽孢杆菌。
38、在一种优选的实施方式中，所述方法包括：
39、步骤一、构建所述芽孢杆菌；
40、步骤二、将所述芽孢杆菌接入发酵培养基中，25-40℃、100-300 rpm，发酵培养1-5h加入0.1-1 mm诱导剂iptg（异丙基-β-d-硫代半乳糖苷），摇瓶培养24-96 h。
41、优选的，
42、所述方法包括：
43、步骤一、构建所述芽孢杆菌；
44、步骤二、将所述芽孢杆菌接入种子培养基，25℃-40℃、100-300 rpm培养12-48 h，获得种子液；
45、步骤三、将所述的种子液接入发酵培养基中od600为0.1-0.5，25℃-40℃、100-300rpm，发酵培养1-5 h加入0.1-1 mm诱导剂iptg，摇瓶培养24-96 h。
46、另一方面，本技术还提供了所述的芽孢杆菌在制备表面活性素和/或提高表面活性素产量和/或降低芽孢产率中的应用。
47、优选的，所述芽孢产率为0，即不产芽孢。
48、优选的，表面活性素产量可达15.77 g/l。
49、另一方面，本技术还提供了一种提高芽孢杆菌表面活性素产量和/或降低芽孢产率和/或提高芽孢杆菌活性的方法，所述方法包括对芽孢杆菌进行如下a1）-a2）任一种或两种改造：
50、a1）调控芽孢合成相关基因
spoivb不表达和/或低表达；
51、a2）表达和/或过表达4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶，所述4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶包含如seq id no.3所示序列或与seq id no.3具有至少95％同一性的氨基酸序列。
52、进一步地，所述的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中的任一种及以上。
53、优选的，所述的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌。
54、更优选的，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（
bacillus subtilis）168。
55、本发明具有如下有益效果：
56、本发明中在枯草芽孢杆菌bs168中通过敲除芽孢合成相关基因
spoivb，并通过强诱导性启动子p
grac过表达具有功能活性的4-磷酸泛酰巯基乙氨转移酶编码基因
sfpth，首次获得了高产表面活性素菌株（s6），其摇瓶发酵生产表面活性素的产量可达15.77 g/l。
57、并且，本发明中发现，经过改造的枯草芽孢杆菌s6的od600高于原始菌株，说明枯草芽孢杆菌s6达到了更高的细胞密度，生物活性更高，为生产表面活性素的工程菌株提供了一种新的改造思路，也证明该菌株改造及改造方法可广泛适用于工业生产中。
58、另外，经过改造的枯草芽孢杆菌s6发酵过程中芽孢产量0%，解决了下游的产物纯化的麻烦，减少了分离纯化的难度和成本，降低了生产成本。