抗甘胆酸-抗体复合物的特异性抗体及其应用的制作方法

本发明属于甘胆酸-抗体检测，更具体的说是涉及抗甘胆酸-抗体复合物的特异性抗体及其应用。

背景技术：

1、以常规肝功能指标诊断肝病存在特异性较差，易受药物或患者生活习惯的影响，难以准确反映患者肝细胞的损伤程度。甘胆酸（cholyglycine, cg）是胆汁酸与甘氨酸结合的代谢产物，主要由肝脏合成并经胆道排泄。血清cg水平异常升高与多种肝胆疾病密切相关，如妊娠期肝内胆汁淤积症（icp）、肝胆管梗阻、慢性肝炎、肝硬化等。甘胆酸是肝胆疾病的重要临床指标，为肝胆疾病的诊断、治疗和预后分析提供了重要依据。

2、甘胆酸是一种相对分子质量仅有465.6的小分子化合物，现有检测方法为高效液相色谱法、酶循环法、放射免疫法、elisa免疫法等。目前市面上甘胆酸检测试剂盒以竞争抑制法为主。竞争抑制法具有特异性高、灵敏度高、成本较低等优点，但也存在重复性较差、信号浓度与强度负相关等局限性。elisa免疫法存在抗体与抗原结合特异性差，假阳性概率高的缺陷。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了用于检测甘胆酸-抗体复合物的特异性抗体及其应用，克服了现有技术中检测血清cg水平重复性差、特异性差的缺陷。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供了抗甘胆酸-抗体复合物的特异性抗体或其抗原结合片段，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区；

4、其中，所述轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列依次包括seq id no.1第24-34位、第50-56位、第89-97位；

5、所述重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列依次包括seq id no.2第31-35位、第50-65位、第98-106位。

6、进一步地，所述轻链可变区还包括框架区fr1、fr2、fr3、fr4，且fr1、fr2、fr3、fr4的氨基酸序列依次包括seq id no.1第1-23位、第35-49位、第57-88位、第98-107位；

7、所述重链可变区还包括框架区fr1、fr2、fr3、fr4，且fr1、fr2、fr3、fr4的氨基酸序列依次包括seq id no.2第1-30位、第36-49位、第66-97位、第107-116位。

8、进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示。

9、如本文中所用，术语“甘胆酸-抗体复合物”是指甘胆酸与能够特异性识别并结合它的抗体所形成的复合物，复合物中cg抗体的所有cg抗原结合位点均被cg分子饱和占据。本发明中的“抗体”以最广义使用，包括多克隆抗体和单克隆抗体，包括完整抗体及其功能性（抗原结合）抗体片段，包括抗原结合（fab）片段、f(ab′)2片段、fab′片段、fv片段、重组igg（rigg）片段、单链抗体片段，包括单链可变片段（sfv或scfv）和单域抗体（例如，sdab、sdfv、纳米抗体）片段。该术语涵盖遗传工程和/或以其他方式修饰形式的免疫球蛋白，例如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异源缀合抗体、多特异性抗体，例如双特异性抗体、三抗体和四抗体、串联双scfv、串联三scfv。除非另有说明，术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。该术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括 igg 及其亚类、igm、ige、iga 和 igd。所述抗体可包含人 igg1 恒定区。所述抗体可包含人 igg4 恒定区。

10、术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”、“抗原结合域”。在一些情况下，抗原结合片段包括fab、fab'、f(ab ')2、fd、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链抗体(例如，scfv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

11、上文所述的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和所述轻链可变区的决定簇互补区均由各自的cdr1、cdr2和cdr3组成；本发明所述cdr为“互补决定区”，是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的“超变环”和/或含有抗原接触残基“抗原接触点”的区域。cdr主要负责与抗原表位结合。一个可变区通常包含3个cdr区，从n端起依次为cdr1、cdr2和cdr3。

12、进一步地，所述抗原结合片段包括fab、fv、scfv、f(ab’)2、线性抗体、单结构域抗体中的任意一种。

13、进一步地，上述特异性抗体或其抗原结合片段中，所述特异性抗体或其抗原结合片段还可包括恒定区。

14、进一步地，所述恒定区可为重链恒定区和轻链恒定区。

15、进一步地，所述重链恒定区可为igg、igm、iga。

16、进一步地，所述igg可为igg1、igg2、igg3或igg4。

17、进一步地，所述轻链恒定区可为lamda（λ）恒定区或kappa（κ）恒定区。

18、进一步地，所述特异性抗体或其抗原结合片段可为鼠的、人的、嵌合的或人源化的。

19、如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或者antibody，在没有特殊标注的情况下，一般是指通常由两对多肽链，每对具有一条“轻”(l)链和一条“重”(h)链组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ 、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“ j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“ d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循kabat sequences of proteins of immunological interest(national institutesofhealth , bethesda , md .(1987 and 1991))，或chothia&lesk(1987)j . mol . biol. 196:901-917；chothia等人(1989)nature 342: 878-883的定义。特别地，重链还可以包含3个以上cdr，例如6、9、或12个。例如在本发明的双功能抗体中，重链可以是igg抗体的重链的c端连接另一个抗体的scfv，这种情况下重链含有9个cdr。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。

20、如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。

21、本发明第二方面提供了与所述的抗体或其抗原结合片段相关的生物材料，所述生物材料包括a1）至a12）中的至少一种：

22、a1）编码所述的特异性抗体或其抗原结合片段的核酸分子；

23、a2）含有a1）所述核酸分子的表达盒；

24、a3）含有a1）所述核酸分子的重组载体；

25、a4）含有a2）所述表达盒的重组载体；

26、a5）含有a1）所述核酸分子的重组微生物；

27、a6）含有a2）所述表达盒的重组微生物；

28、a7）含有a3）所述重组载体的重组微生物；

29、a8）含有a4）所述重组载体的重组微生物；

30、a9）含有a1）所述核酸分子的重组细胞；

31、a10）含有a2）所述表达盒的重组细胞；

32、a11）含有a3）所述重组载体的重组细胞；

33、a12）含有a4）所述重组载体的重组细胞。

34、上述生物材料中，a2）所述的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述特异性抗体或其抗原结合片段的dna。所述表达盒还可包括表达上述蛋白的核酸分子所必需的所有调控序列的单链或双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达上述蛋白质。所述调控序列包括但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与编码蛋白质的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导蛋白质表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内蛋白质的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码蛋白质的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mrna非翻译区。前导序列可操作连接于编码蛋白质的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在蛋白质氨基端的氨基酸序列，能引导编码蛋白质进入细胞分泌途径。能引导表达后的蛋白质进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。添加能根据宿主细胞的生长情况来调节蛋白质表达的调控序列可能也是需要的。调控序列的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码蛋白质的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。

35、上述生物材料中，a3）所述重组载体可为克隆载体，也可为表达载体。如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

36、制备表达载体时，可使编码上述蛋白的核酸分子位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。重组表达载体可以是任何便于进行重组dna操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，能整合到染色体中并与所整合的染色体一起复制的载体。所述载体含有1或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，fehrlich ,1978，美国国家科学院学报75：1433)。可以向宿主细胞插入1个以上拷贝的编码上述蛋白质的核酸分子以提高该基因产物的产量。该核酸分子的拷贝数增加可以通过将该核酸分子的至少1个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸分子一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸分子的细胞。用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。

37、上述生物材料中，a5）所述重组微生物具体可为细菌、酵母、藻和真菌。所述细菌可为下述任一种：

38、1）原核微生物；

39、2）革兰氏阴性细菌；

40、3）埃希氏菌属细菌；

41、4）大肠杆菌。

42、上述生物材料中，a9）-a12）所述的重组细胞可以为动物细胞，所述动物细胞系可为非繁殖材料。所述动物细胞可为离体的哺乳动物细胞。所述哺乳动物包括人或鼠。所述哺乳动物细胞可不包括动物生殖细胞、动物受精卵和动物胚胎干细胞，如可为体细胞或细胞系。所述动物细胞可为来源于鼠的细胞系或体细胞。

43、本发明第三方面提供了制备所述的特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合的条件下以所述甘胆酸-抗体复合物免疫哺乳动物， 分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选分泌目标抗体的杂交瘤细胞，纯化抗体。

44、本发明第四方面提供了一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分所述抗体部分包含所述的特异性抗体或其抗原结合片段。

45、本发明第五方面提供了所述的特异性抗体或其抗原结合片段或所述的生物材料或所述的抗体偶联物在如下至少一种中的应用；

46、b1）制备检测或辅助检测或诊断甘胆酸-抗体复合物的产品；

47、b2）制备筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断肝胆疾病的产品；

48、b3）制备结合甘胆酸-抗体复合物的产品；

49、其中，所述检测包括直接免疫检测法、间接免疫检测法；

50、所述产品包括试剂盒；所述试剂盒包括胶乳增强免疫比浊试剂盒、化学发光免疫分析试剂盒、elisa试剂盒。

51、本发明第六方面提供了一种检测或辅助检测甘胆酸-抗体复合物的产品，包括所述的特异性抗体或其抗原结合片段或所述的生物材料或所述的抗体偶联物。

52、进一步地，所述检测或辅助检测甘胆酸-抗体复合物的产品，具有如下至少一种功能：

53、c1）检测或辅助检测甘胆酸-抗体复合物；

54、c2）筛查或辅助筛查肝胆疾病；

55、c3）结合甘胆酸-抗体复合物。

56、具有本发明抗体的检测试剂相对于现有的试剂盒具有更优的性能，特异性结合能力更强并且假阳性概率小。