一种靶向GIPR的纳米抗体及其制备与应用的制作方法

本发明涉及抗体领域，尤其涉及一种靶向gipr的纳米抗体及其制备与应用。

背景技术：

1、胰高血糖素样肽-1（glp-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（gip）是肠道来源的肠促胰岛素激素，能够增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌，并且已被证明在体重调节中发挥重要作用。除了肠促胰岛素效应外，glp-1能够促进饱腹感，而gip则促进脂肪储存和代谢调节。目前，已有多种glp-1受体激动剂（glp-1ra）被批准用于治疗2型糖尿病和肥胖。虽然glp-1ra已有了不错的治疗效果，但治疗后仍有停药后反弹，减重也减肌，胃肠道副作用严重等问题，人们通过研究发现多通路调节能更好的减重，减重效果更持久，同时获得更好的耐受性，因此逐渐开始开发多种glp-1ra联合治疗方法。针对多个肠促胰岛素通路的单分子多特异性激动剂肽作为一种有前景的减肥治疗策略已经崭露头角。

2、在人类中进行的全基因组关联研究（gwas）显示，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体（gipr）基因位点与体重（bw）调节相关，而gipr基因敲除小鼠能够抵抗饮食诱导的肥胖（dio）1-2。此外，近期的机制研究表明，在中枢神经系统，不同于gipr激动剂通过gaba能神经元抑制食欲，gipr拮抗剂的食欲抑制作用依赖于glp-1信号通路，能减少对glp-1信号通路的抑制进而抑制食欲，同时减少肝脏和脂肪组织中的炎症和胆固醇合成；在外周组织中，gipr拮抗剂能减少脂肪合成和储存。gipr拮抗剂单用已经能降低肥胖动物的食欲，减轻体重，而与glp-1ra联用能有更显著的效果3。将gipr拮抗剂与glp-1激动剂组成双靶点分子，能够协同降低dio小鼠和肥胖食蟹猴的体重，并改善代谢参数4。目前临床上研发最靠前的gipr拮抗剂/glp-1激动剂amg133在临床研究中也展示了良好的减肥效果，在临床一期实验中用药12周能减重14.5%，且停药后减重效果能维持150天；在临床二期实验中，在用药后52周，能减重20%，且未达平台期。

3、目前针对gipr的治疗型抗体拮抗剂有两个，都是与glp-1多肽偶联或融合表达，一个是amg133，目前准备开展临床三期；另一个是gma-106，目前处在临床一期。这两个双靶点分子的gipr拮抗剂部分均只有human gipr拮抗活性，小鼠gipr交叉活性较弱或无。

4、目前专利数据库中有多个gipr大分子类拮抗剂相关专利，除了amg133和gma-106相关专利外，antag therapeutics和novo nordisk分别申请了多肽拮抗剂，swiftnovotherapeutics inc和crystal bioscience inc分别申请了抗体拮抗剂，suzhou alphamab申请了vhh（纳米抗体）拮抗剂。抗体形式与本专利最接近的是suzhou alphamab的vhh拮抗剂，但其抗体的体内活性较弱（wo2024094076a1）。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是目前针对gipr的治疗型抗体拮抗剂只有humangipr拮抗活性，小鼠gipr交叉活性较弱或无，且体内活性弱的问题，本发明提供一种靶向gipr的纳米抗体及其制备与应用。本发明提供的纳米抗体以及复合物有人鼠交叉活性，且gipr拮抗活性较佳。

2、本发明一方面提供一种靶向gipr的纳米抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含cdr1、cdr2和cdr3，cdr1的氨基酸序列如seq id no: 4所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no: 5所示，且cdr3的氨基酸序列如seq id no: 6所示。

3、本文中的术语“纳米抗体”，又称为“单域抗体”，仅包含一个重链可变区vhh，分子量约为15kda，直径约10纳米，其通常保留了全部的抗原结合能力，是最小的保留完整抗原结合片段。

4、在本发明中，上述所列cdr的氨基酸序列均是按照kabat编号系统定义规则所示出的。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，术语给定抗体或其区域（例如可变区）的“cdr”或“互补决定区”应理解为涵盖通过任何一种界定的互补决定区。因此，在涉及用本发明定义的具体cdr序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体cdr序列，但是由于应用了不同的方案（例如不同的指派系统规则或组合）而导致其所声称的cdr边界与本发明所定义的具体cdr边界不同。虽然本发明请求保护的范围是基于kabat编号系统定义规则所示出的序列，但是根据其他cdr的定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中，例如根据aho编号系统定义规则，本发明所述序列seq id no: 3中，互补决定区（cdr）的氨基酸位置划分为，cdr1：位于第26至32位氨基酸（含两端位点）；第50-56位为cdr2的氨基酸序列，第95-117位为cdr3的氨基酸序列。

5、本发明的权利要求保护范围虽以kabat编号系统定义的cdr序列为基础，但该范围同样涵盖了依据其他公认编号规则（例如aho系统）所确定的对应氨基酸序列；具体到本发明的抗体人源化过程中，实际采用了kabat与aho两套规则的综合认定策略，即cdr1依据kabat扩展规则（kabat extended）界定、cdr2遵循kabat规则、而cdr3则采用aho规则进行界定。

6、术语“可变区”指抗体重链中涉及抗体结合抗原的域。vh包含四个保守的框架区（fr）和三个互补决定区（cdr）。其中，术语“互补决定区”或“cdr”指可变结构域内主要促成与抗原结合的区域；“框架”或“fr”是指除cdr残基之外的可变结构域残基。vh包含3个cdr区：cdr1、cdr2和cdr3。每个vh由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。

7、如本领域中已知，重链的可变区由通过三个互补决定区(cdr)(也称为高变区)连接的四个框架区(fr)组成，并且促成抗体的抗原结合位点的形成。若需要对象可变区的变体，特别是具有cdr区外部(即在框架区中)的氨基酸残基的取代，则可通过将对象可变区与含有与对象可变区相同的典型种类中的cdr1和cdr2序列的其它抗体的可变区进行比较来鉴定适当的氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。

8、在一些实施方案中，所述纳米抗体为驼源纳米抗体或人源化纳米抗体。

9、在一些实施方案中，所述纳米抗体的框架区来源于人种系重链，包含以下任一种：

10、1）ighv3-6601和/或ighj402；

11、2）ighv3-2301和/或ighj603；和，

12、3）ighv3-1501和/或ighj502。

13、在一些实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no: 1-3任一项所示或与seq id no: 1-3任一项所示的氨基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

14、本发明另一方面提供一种靶向gipr的复合物，所述复合物包含本发明提供的所述纳米抗体；所述复合物为重链抗体、同源多聚体或复合功能融合体；所述同源多聚体例如二价或多价vhh。

15、重链抗体（heavy chain antibody，hcab）是存在于骆驼和鲨鱼类动物体内，轻链天然缺失，只有重链组成的新型抗体分子。重链抗体和普通的抗体相比虽然缺失了轻链，但是依然保留结合抗原的能力。

16、在一些实施方案中，所述重链抗体为骆驼重链抗体。

17、同源多聚体，vhh抗体形成的同源多聚体是指由多个相同的vhh单域抗体分子通过非共价相互作用（主要是通过其框架区特定氨基酸残基的相互作用）自发组装形成的蛋白质复合物。vhh（驼源重链抗体可变区）本身是天然存在的单域抗体片段，其小分子量和稳定性使其易于形成同源二聚体、三聚体甚至更高阶的多聚体；这种多聚化能显著提高vhh对抗原的亲和力（亲合力效应）和结合稳定性，并可能产生新的结合特性或增强其中和活性。

18、复合功能融合体，vhh抗体形成的复合功能融合体是指通过基因工程技术将vhh单域抗体的编码序列与其他功能蛋白或结构域（如毒素、酶、细胞因子、人抗体fc片段、荧光蛋白等）进行融合表达所形成的人工重组蛋白。这种设计使融合体同时保留vhh的高亲和力靶向特异性，并整合融合元件的生物活性（如细胞杀伤、信号激活、延长半衰期或可视化追踪），从而扩展其在治疗、诊断或研究中的应用价值，例如构建多肽-抗体融合蛋白、双特异性抗体、免疫毒素或体内成像探针。

19、在一些实施方案中，所述复合功能融合体选自以下任一种：

20、1）包含本发明提供的所述纳米抗体和人源fc的融合蛋白；所述人源fc的氨基酸序列优选如seq id no: 7所示或与seq id no: 7所示的氨基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性；和，

21、2）包含本发明提供的所述纳米抗体和glp-1多肽或其类似物的多肽-抗体融合蛋白；所述glp-1类似物例如具有如seq id no: 8所示的氨基酸序列。

22、在一些实施方案中，所述多肽-抗体融合蛋白还包含fc。

23、vhh-fc融合蛋白是将驼源纳米抗体（vhh）与人源抗体的fc片段（如igg1或igg4fc）通过基因工程融合形成的重组蛋白，兼具vhh的高亲和力、小分子穿透性和fc的长半衰期（通过fcrn介导循环）及效应功能（如adcc/cdc，取决于fc亚型）。其设计通常加入柔性连接肽（如g4s）以确保结构域独立性，广泛应用于肿瘤靶向治疗（如双特异性抗体）、抗感染药物和长效化制剂开发（如caplacizumab的变体），同时可通过fc工程化（如突变降低免疫原性）进一步优化安全性和药效。

24、glp-1（胰高血糖素样肽-1）通过结构修饰（如抗dpp-4降解、脂肪酸链修饰、fc融合或peg化）开发的glp-1类似物（如利拉鲁肽、索马鲁肽、度拉糖肽）显著延长了半衰期，实现每日或每周给药，成为治疗2型糖尿病和肥胖的核心药物，兼具心血管保护潜力。

25、在一些实施方案中，所述多肽-抗体融合蛋白从n端到c端依次包含glp1多肽或其类似物、fc和纳米抗体。

26、在一些实施方案中，所述纳米抗体和glp-1多肽或其类似物通过连接子与fc连接。

27、在一些实施方案中，所述glp-1多肽或其类似物与fc通过第一连接子连接，和/或，所述fc与纳米抗体通过第二连接子连接。

28、在一些实施方案中，所述复合功能融合体从n端到c端依次包含glp1多肽或其类似物、第一连接子、fc、第二连接子和纳米抗体。

29、在一些实施方案中，所述多肽-抗体融合蛋白中，所述fc为igg4-fc；和/或，所述连接子为柔性连接肽。

30、柔性连接肽是蛋白质工程中一类富含甘氨酸和丝氨酸的短肽序列，最经典的为(g4s)n（即ggggs，seq id no: 14）重复单元，其设计初衷在于为融合蛋白的不同功能域提供充足的空间自由度与柔韧性；其中甘氨酸因侧链最小赋予了肽链主链高度弯折的能力，而丝氨酸的极性侧链则增强了亲水性，有助于防止蛋白聚集并维持溶解性。在实际应用中，通过调整重复次数（如n=1至4）可精确控制连接臂长度，以确保各功能域能独立折叠并发挥其生物学活性，避免因空间位阻或域间干扰导致功能丧失，因此在双特异性抗体、纳米抗体融合及酶工程等生物医药前沿领域发挥着关键的工具性作用。

31、在一些实施方案中，igg4-fc的氨基酸序列如seq id no: 10所示或与seq id no:10所示的氨基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

32、在一些实施方案中，所述第一连接子的氨基酸序列如seq id no: 9所示。

33、在一些实施方案中，所述第二连接子的氨基酸序列如（g4s）3所示，即ggggsggggsggggs，seq id no: 15。

34、gipr抗体或纳米抗体与glp-1多肽/类似物的融合蛋白是一类创新的双功能生物药物，通过将靶向胃抑制肽受体（gipr）的抗体/vhh与glp-1受体激动剂（如索马鲁肽）偶联，实现协同代谢调控。这类分子既能通过gipr抗体调节gip信号通路（激动或拮抗），又能通过偶联的glp-1类似物激活glp-1受体，双重作用于胰岛素分泌、食欲抑制和能量代谢。其设计包含化学偶联（如amg 133）或基因融合（如本发明的vhh-glp-1-fc）两种形式，兼具靶向特异性（如脂肪组织）和长效性（fc介导半衰期延长），在肥胖和糖尿病治疗中展现出优于单靶点药物的潜力。

35、在一些实施方案中，所述多肽-抗体融合蛋白的氨基酸序列如seq id no: 11所示或与seq id no: 11所示的氨基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

36、本发明另一方面提供一种分离的核酸，所述分离的核酸编码本发明提供的所述纳米抗体，或者本发明提供的所述复合物。

37、在一些实施方案中，所述分离的核酸包含如seq id no: 12所示的核苷酸序列，优选还包含如seq id no: 13所示的核苷酸序列。

38、如本领域已知，在本发明中“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或者能够通过dna或rna聚合酶掺入链的任何底物。

39、本发明另一方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明提供的所述分离的核酸。

40、在一些实施方案中，所述重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

41、在一些实施方案中，所述真核表达载体为病毒载体或非病毒质粒载体。

42、在一些实施方案中，所述非病毒质粒载体的骨架为pcdna3.4。

43、术语“重组表达载体”意指基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mrna、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，并且载体在足以使mrna、蛋白质、多肽、或肽在细胞内表达的条件下与细胞接触时，所述构建体允许由宿主细胞表达mrna、蛋白质、多肽或肽。本公开的载体总体上不是天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于如下dna和rna：其可以是单链或双链的，合成的或部分地从天然来源中获得，并且其可以含有天然、非天然或改变的核苷酸。合适的载体包括经过设计用于扩展和扩增或用于表达或以上两项的那些载体，载体的实例包括但不限于病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的dna或rna表达载体、包囊化于脂质体中的dna或rna表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。

44、本发明另一方面提供一种转化体，所述转化体包含本发明提供的所述分离的核酸或本发明提供的所述重组表达载体；所述转化体为非动植物品种。

45、在一些实施方案中，所述转化体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

46、在一些实施方案中，所述宿主细胞为昆虫细胞、哺乳动物细胞或酵母细胞。

47、在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞为hek293或cho-k1细胞，例如expi293f细胞。

48、如本文所使用，术语“转化体”是指已导入本文所描述的核酸或载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或海藻；或宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。

49、可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因编辑（crispr-cas系统、zfn系统或talen系统）、转座子（sleeping beauty或piggybac）、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和宿主细胞变动或优化。另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将dna掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性（例如，抗生素）或重金属（如铜）抗性等。可选择标记基因可以与待表达的dna序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mrna。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

50、本发明另一方面提供一种制备本发明提供的所述纳米抗体，或者本发明提供的所述复合物的方法，所述方法包括培养本发明提供的所述转化体获得培养物。

51、在一些实施方案中，从培养物中纯化所述纳米抗体或者复合物。

52、本发明另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明提供的所述纳米抗体、本发明提供的所述复合物、本发明提供的所述分离的核酸、本发明提供的所述重组表达载体或本发明提供的所述转化体。

53、在一些实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

54、在一些实施方案中，本发明的药物组合物或药物制剂包含合适的药学上可接受的载体例如药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。如本发明所用，“药学上可接受的辅料”或“药用辅料”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂（vehicle）包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“handbook ofpharmaceuticalexcipients”, 第五版, r.c.rowe, p.j.seskey 和s.c.owen,pharmaceutical press, london,chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph调节剂/缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放制剂等的形式。口服制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体或其抗原结合片段与一种或多种任选的药用辅料（remington’s pharmaceutical sciences，第16版，osol，a. 编（1980））混合来制备包含本发明所述的药物制剂或药物组合物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它活性成分，例如其它抗体、抗病毒活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的抗体或其抗原结合片段的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

55、本发明另一方面提供本发明提供的所述纳米抗体、本发明提供的所述复合物、本发明提供的所述分离的核酸、本发明提供的所述重组表达载体、本发明提供的所述转化体或本发明提供的所述药物组合物在制备预防和/或治疗代谢性疾病的药物中的用途。

56、如背景技术中提到的gipr基因敲除小鼠能够抵抗饮食诱导的肥胖（dio），gipr信号通路在代谢性疾病的病理生理过程中发挥核心作用。在gipr拮抗剂方面，amg 133（一种gipr拮抗抗体与glp-1类似物的偶联物）在1期临床试验中显示出剂量依赖性的体重降低效果，最高剂量组（420 mg，每4周给药一次）在85天内实现平均体重降低14.5%，且效果持续至末次给药后150天。此外，amg 133在dio小鼠和肥胖食蟹猴中显著降低空腹血糖、血浆胰岛素、甘油三酯和总胆固醇水平。在本技术中，本技术提供的多肽-抗体融合蛋白（glp1/gipr）减重效果显著优于dulaglutide（第25天，与初始平均体重比较，分别减少16%和4.8%；第32天体重分别减少15.6%和4.8%，本技术提供的多肽-抗体融合蛋白和模型对照相比显著减低了dio小鼠的血脂含量，显著提高了dio小鼠对葡萄糖的耐受性（one-way anova,p<0.01），并显著降低了血清胰岛素含量。这些临床前和临床数据充分证明，本技术提供的靶向gipr的纳米抗体及多肽-抗体融合蛋白可用于预防和/或治疗代谢性疾病。

57、在一些实施方案中，所述代谢性疾病选自糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝病/肝炎、糖尿病肾病和心血管疾病中的一种或多种。

58、在一些实施方案中，所述心血管疾病选自心力衰竭、冠心病、心肌病和心律失常中的一种或多种。

59、在一些实施方案中，所述代谢性疾病是由于与gipr相关的信号通路异常引起的。

60、本发明另一方面提供一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括本发明提供的所述纳米抗体、本发明提供的所述复合物或本发明提供的所述药物组合物。

61、本发明另一方面提供本发明提供的所述纳米抗体、本发明提供的所述复合物、本发明提供的所述分离的核酸、本发明提供的所述重组表达载体、本发明提供的所述转化体或本发明提供的所述药物组合物在制备具有以下任一种或多种功能的产品中的用途：

62、1)抑制gipr受体；

63、2)活化glp-1r受体；

64、3)降低体重；

65、4)降低血糖；

66、5)降低血脂；

67、6)降低体脂；

68、7)降低体脂比；

69、8)提高葡萄糖耐受；

70、9)降低血清胰岛素含量；和，

71、10)抑制gipr蛋白与其配体gip结合。

72、在一些实施方案中，上述产品作为药物用于治疗疾病。

73、在一些实施方案中，上述产品作为高特异性、高亲和力的实验用试剂，广泛应用于体外药物开发和机理研究。在体外药物开发中的应用：

74、gipr受体功能研究：gipr纳米抗体可用于体外细胞实验中gipr受体功能的检测和调控。例如，在表达人gipr的hek293t或cho细胞中，gipr纳米抗体可用于竞争性抑制gip诱导的camp积累，从而评估候选药物的拮抗活性。已有研究（如gipg013抗体和amg 133）通过camp assay验证了gipr抗体的拮抗作用，ic50值在纳摩尔级别（如amg 133的ic50为42.4nm）。

75、gipr/glp-1r双靶点药物筛选：gipr纳米抗体可作为工具分子，用于体外筛选和验证gipr/glp-1r双靶点药物。例如，将gipr纳米抗体与glp-1r激动肽偶联，可在体外细胞模型中评估双靶点协同效应，包括camp信号放大、受体内化和内体信号传导等。

76、药物-受体结合研究：gipr纳米抗体可用于表面等离子体共振（spr）、生物层干涉（bli）等体外结合实验中，测定候选药物与gipr的结合亲和力（kd）和动力学参数。例如，gipg013抗体通过spr测定与人gipr-ecd的亲和力为kd = 6.8 nm。

77、高通量药物筛选：gipr纳米抗体可作为阳性对照或检测试剂，用于高通量筛选（hts）平台中gipr调节剂的发现。例如，在基于camp报告基因或钙流检测的高通量筛选中，gipr纳米抗体可用于验证筛选体系的特异性和灵敏度。

78、在机理研究中的应用：

79、gipr信号通路研究：gipr纳米抗体可用于体外研究gipr介导的下游信号通路，包括camp/pka通路、pi3k/akt通路、mapk/erk通路和钙信号通路等。通过使用gipr纳米抗体阻断gip与gipr的结合，可以研究gipr信号在特定细胞类型（如胰岛β细胞、脂肪细胞、心肌细胞）中的功能。

80、gipr受体结构生物学研究：gipr纳米抗体可作为结晶伴侣（crystallizationchaperone），用于gipr蛋白的晶体结构解析。已有研究利用gipr抗体片段（如fab或vhh）稳定gipr的活性构象或非活性构象，从而解析gipr与配体或g蛋白的复合物结构。

81、gipr受体表达和定位研究：gipr纳米抗体可用于免疫荧光（if）、免疫组化（ihc）和流式细胞术等实验中，检测gipr在细胞表面或组织中的表达水平和亚细胞定位。已有商业化抗gipr vhh单域抗体（如creative biolabs的nab-1106-sdab）被用于上述应用。

82、gipr与配体相互作用研究：gipr纳米抗体可用于体外研究gipr与其配体gip的相互作用机制，包括结合位点、结合动力学和构象变化等。通过竞争性结合实验，可以解析gipr纳米抗体的表位与gip肽在gipr ecd上的停靠位点之间的关系。

83、因此，本发明提供的gipr纳米抗体、复合物或药物组合物可作为实验用试剂，在体外药物开发和机理研究中使用。

84、另一方面提供一种确定gipr蛋白的存在或含量的方法，所述方法包括使用本发明提供的所述纳米抗体、本发明提供的所述复合物、本发明提供的药物组合物或本发明提供的试剂或试剂盒与待测物质接触。

85、在一些实施方案中，所述方法为非诊断治疗目的的。

86、在一些实施方案中，所述gipr蛋白为人源或鼠源gipr蛋白。

87、在一些实施方案中，可以在科研检测、药物筛选、动物模型体外研究、质控场景下确定gipr蛋白的存在或含量。在科研检测场景下，可以通过western blot / elisa、流式细胞术（facs）、免疫组化/免疫荧光（ihc/if）免疫沉淀（ip），使用本发明提供的所述纳米抗体、本发明提供的所述复合物、本发明提供的药物组合物或本发明提供的试剂或试剂盒定性或定量检测组织、细胞裂解液中的gipr蛋白含量。在药物研发与筛选场景下，例如在细胞株筛选中，可以在构建gipr高表达细胞模型（如用于筛选gipr激动剂/拮抗剂的工程细胞株）时，用该纳米抗体鉴定和分选阳性细胞；还可以，以该纳米抗体为工具，筛选与其竞争结合gipr的候选药物分子；同时，检测给药前后gipr表达量/内吞变化，评估药物作用机制。在临床前动物模型研究场景中，可以在小鼠肥胖/糖尿病模型，小鼠死亡后使用抗体检测gipr的表达与分布，支持药效（pd）和机制研究。在质量控制场景下，可以用于重组gipr蛋白产品、gipr表达细胞株的放行检测与批间一致性控制。

88、本发明另一方面提供一种抑制gipr蛋白与其配体结合的方法，所述方法包括使用本发明提供的所述纳米抗体、本发明提供的所述复合物、本发明提供的药物组合物或本发明提供的试剂或试剂盒与gipr蛋白接触，所述配体优选为gip。

89、在一些实施方案中，所述方法为非诊断治疗目的的。

90、在一些实施方案中，用纳米抗体阻断gipr与其天然配体gip的结合可以使用场景例如：在细胞或组织水平用该纳米抗体抑制gipr下游信号（如camp生成、胰岛素分泌），用于解析gipr在糖脂代谢中的生物学功能；以该纳米抗体为阳性参照或竞争工具，通过竞争结合实验筛选和评估其他gipr拮抗剂候选分子（如小分子或抗体）；在开发gipr拮抗类减重/降糖药物（gipr拮抗是当前肥胖治疗的重要方向）时，验证候选分子对配体-受体结合的阻断效果。

91、本发明另一方面提供一种预防和/或治疗代谢性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明提供的所述纳米抗体、本发明提供的所述复合物或本发明提供的药物组合物。

92、在一些实施方案中，所述代谢性疾病选自糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝病/肝炎、糖尿病肾病和心血管疾病中的一种或多种。

93、在一些实施方案中，所述心血管疾病选自心力衰竭、冠心病、心肌病和心律失常中的一种或多种。

94、如本发明所用，术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示，与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。

95、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

96、本发明所用试剂和原料均市售可得。

97、本发明的积极进步效果在于：

98、本发明利用噬菌体展示技术，快速高效地筛选到了与人hgipr和鼠mgipr过表达细胞结合活性较高，拮抗活性较强的候选分子ab65，优于目前治疗效果最好的amg133的mab部分（gipr拮抗活性部分），以下简称ref mab。

99、候选分子ab65与glp-1多肽类似物组成的双靶点分子glp-1/gipr v1在人hgipr、人hglp-1r和人hgipr-hglp-1r共表达细胞上均展现出了优异的体外活性，同时该双靶点分子在小鼠dio模型中也展现了优异的减肥效果，改善了代谢相关指标。

100、候选分子ab65人源化后仍能保持与人hgipr过表达细胞的结合活性、拮抗活性和人鼠交叉活性。

101、候选分子ab65或其人源化后分子是未来治疗代谢性疾病的新的候选药物。