抗昆虫HSP70纳米抗体及其用途的制作方法

本发明在其一些实施方式中涉及抗昆虫hsp70纳米抗体及其用途。

背景技术：

1、在过去70年里，昆虫害虫的管理主要是通过施用合成农药来实现的。自paul müller于1939年发现ddt的杀虫特性以来，已经开发了数百种杀虫化合物，同时杀虫剂的使用也相对稳定地增加。目前使用的大多数化学杀虫剂都有很高的破坏生态系统的潜力，它们直接或通过食物链对人类有毒，并且它们的使用也受到昆虫遗传抗性发展的阻碍。目前使用的最突出的生物解决方案包括减少昆虫危害的有益生物或天敌、充当诱饵或危害繁殖的信息素、释放不育雄性、喷洒苏云金芽孢杆菌毒素或使用含有对昆虫致命但对人无害的苏云金杆菌毒素基因的转基因作物。然而，这些生物解决方案也有缺点，包括效率低、有破坏自然生态平衡的危险和发展遗传昆虫抗性（例如，在使用芽孢杆菌毒素的情况下）。

2、纳米抗体，也称为vhh抗体，是单结构域抗体，其实际上含有抗体的重链（hcab），并且完全没有轻链。它们是由雷蒙德·哈默斯在骆驼血液中发现的，他于1989年在布鲁塞尔自由大学获得了这一发现。纳米抗体是最小的可用完整抗原结合片段（cortez–retamozo等人，2004；revets等人，2005），大小约为15kda。纳米抗体具有显著的优势，包括在各种表达系统中的高产量，它们的最小尺寸允许对其表位的高度可及性，高物理化学稳定性，可逆的复性和在水溶液中的高溶解度，高度均匀，没有自发二聚化的迹象，并且能够特异性识别具有亚纳摩尔亲和力的独特表位。先前已经建议使用纳米抗体作为杀虫剂（参见例如ep专利申请公开号：ep3415010和ep2609116；美国专利公开号：us9516879；美国专利申请公开号：us9803003b2；以及国际专利申请公开号wo2014191146和wo2021/095031）。

3、热休克蛋白70（hsp70）是一种在从细菌到人类的多种生物体中表达的分子伴侣，其在细胞稳态和应激反应中起着关键作用。这种伴侣蛋白有助于其他蛋白质的正确折叠、蛋白质易位和多聚体复合物易位，有助于在不利条件下维持细胞稳态。昆虫hsp70在极端温度、病原体感染和环境毒素等各种压力下被显著诱导。显示在高温胁迫下，大量hsp70被合成以保护昆虫免受高温损伤。此外，显示昆虫hsp70与细胞对杀虫剂和其他外源性胁迫的保护有关。[bai等人（2021）international journal of biological m acromolecules：parta，193，933-940；wolfe等人（1998）journal of insect physiology，44，597-603；liu f等人（2008）pestic. biochem. physiol.，91: 45-52]。此外，显示通过rna干扰敲除hsp70会导致桃蚜无翅成虫对拟除虫菊酯的易感性增加[dong等人（2022）pestic biochem physiolfeb 181]；以及粉虱死亡率的增加[vyas m等人（2017）plos one 12（1）：e0168921]。

4、其他背景技术包括：

5、国际专利申请公开号wo2023056361和wo2021195557；以及中国专利申请公开号cn116355090。

技术实现思路

1、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种与昆虫hsp70特异性结合的纳米抗体，其中纳米抗体与昆虫hsp70结合赋予纳米抗体昆虫防治活性。

2、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体进一步包括具有昆虫防治活性的异源毒素部分。

3、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体下调昆虫hsp70的活性。

4、根据本发明的一些实施方式，该纳米抗体包括seq id no:3-5、7-9、11-13、15-17、19-21、23-25、27-29、31-33、35-37、39-41、43-45、47-49、51-53、55-57、59-61、63-65、67-69、71-73、75-77、79-81、83-85、87-89、91-93、95-97、99-101、103-105、107-109、111-113、115-117、119-121、123-125、127-129、131-133、135-137、139-141、143-145、147-149、151-153、155-157、159-161、163-165、167-169、171-173或175-177中列出的三个互补决定区（cdr），这三个互补决定区在纳米抗体上按从n到c的顺序排列。

5、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体包括seq id no:15-17、31-33、55-57或59-61中列出的三个互补决定区（cdr），这三个互补决定区在纳米抗体上按从n到c的顺序排列。

6、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体包括seq id no:15-17中列出的三个互补决定区（cdr），这三个互补决定区在纳米抗体上按从n到c的顺序排列。

7、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种编码纳米抗体的多核苷酸。

8、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种核酸构建体，其包括多核苷酸和用于指导多核苷酸表达的顺式作用调控元件。

9、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种宿主细胞，其包括纳米抗体或编码纳米抗体的多核苷酸或核酸构建体。

10、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种生产昆虫防治纳米抗体的方法，该方法包括培养细胞。

11、根据本发明的一些实施方式，该方法包括分离纳米抗体。

12、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种昆虫防治方法，该方法包括使昆虫与纳米抗体、编码纳米抗体的多核苷酸或核酸构建体或表达纳米抗体的宿主细胞接触。

13、根据本发明的一些实施方式，接触包括将纳米抗体直接施加到昆虫。

14、根据本发明的一些实施方式，接触包括将纳米抗体施加到可能与昆虫接触的生物体或表面。

15、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体被配制为通过喷雾、灌溉和/或熏蒸递送。

16、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体被配制为液体制剂。

17、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体被配制为干制剂。

18、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种植物，其包括纳米抗体或编码纳米抗体的多核苷酸或核酸构建体。

19、根据本发明的一些实施方式，植物是转基因植物。

20、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种包括纳米抗体的商品产品。

21、根据本发明的一些实施方式，商品产品由植物生产。

22、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种生产纳米抗体的方法，该方法包括用重组或纯化的昆虫hsp70免疫骆驼科动物，其中昆虫多肽制剂中的昆虫hsp70的纯度为至少80%。

23、根据本发明的一些实施方式，该方法包括在免疫后分离纳米抗体。

24、根据本发明的一些实施方式，骆驼科动物是大羊驼。

25、根据本发明的一些实施方式，昆虫选自由粉虱、蚜虫、蛾、椿象、叶蝉、甲虫和蜜蜂组成的组。

26、根据本发明的一些实施方式，昆虫是粉虱。

27、根据本发明的一些实施方式，粉虱是烟粉虱。

28、根据本发明的一些实施方式，昆虫是蚜虫。

29、根据本发明的一些实施方式，蚜虫是桃蚜。

30、根据本发明的一些实施方式，昆虫是蛾。

31、根据本发明的一些实施方式，蛾是草地贪夜蛾（spodoptera frugiperda）。

32、除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明实施方式的实践或测试中可以使用与本文所述类似或等效的方法和材料，但下面描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书（包括定义）为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不一定是限制性的。