一种用于斑点热群立克次体OmpA基因CRISPR检测的crRNA及引物组合的制作方法

本发明涉及一种核酸的检测方法，属于微生物检测应用领域。

背景技术：

1、立克次体（rickettsia）属包含几个毒力物种，是经蜱叮咬传播的专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，分为斑点热群（spotted fever group, sfg）和斑疹伤寒群（typhusgroup, tg）两大类群，其中，斑点热是一组由斑点热群立克次体( spotted fever grouprickettsiae，sfgr)感染的自然疫源性人兽共患疾病。1982年我国首次在黑龙江地区的森林革蜱、日本血蜱和嗜群血蜱身上分离出黑龙江立克次体，长期调查研究表明其分布较广，已在我国十几个省市、自治区证实存在sfgr，目前已证实有19种sfgr对人类有致病性，不断有新发物种被归类于这一种群，且人群对该病原普遍易感。斑点热患者的主要临床表现为发热、头痛、恶心呕吐、斑丘疹、局部淋巴结肿大等，严重者可危及生命。由于病程早期缺乏特异性症状和焦痂证据，易导致误诊漏诊，从而延误治疗。该病原体对四环素类抗生素较为敏感，因此，在感染早期快速准确诊断疑似病例，并给予有效抗菌药物治疗，可大大减少死亡率。本领域亟须建立一种兼具简易便捷、高灵敏度、高特异度的斑点热群立克次体检测技术。

2、本发明的目的是基于crispr-cas系统，结合多酶恒温快速扩增与crispr荧光检测技术，建立一种可以快速检测斑点热群立克次体的高灵敏、高特异的核酸检测方法。

技术实现思路

1、基于上述目的，本发明首先提供了一种用于crispr-cas13a技术检测斑点热群立克次体的核酸的crrna分子，所述crrna分子的体外转录模板的序列选自seq id no.3、seqid no.7、seq id no.11、seq id no.13中的任一序列。

2、其次，本发明提供了一种应用所述crrna分子基于非诊断目的的crispr-cas13a技术检测斑点热群立克次体的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

3、（1）制备样本核酸模板；

4、（2）使步骤（1）获取的核酸模板，cas13a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针，t7rna聚合酶，以及所述crrna分子在crispr-cas13a反应体系里反应；

5、（3）对步骤（2）的反应体系进行荧光强度的检测。

6、在一个优选的实施方案中，步骤（1）所述的样本核酸模板由多酶恒温快速扩增方法制备。

7、在一个更为优选的实施方案中，所述多酶恒温快速扩增方法使用的上游引物与下游引物的序列分别如seq id no.16与seq id no.25、seq id no.16与seq id no.26、seqid no.16与seq id no.27或seq id no.17与seq id no.25所示。

8、更为优选地，所述crrna分子体外转录模板的序列如seq id no.11所示，所述多酶恒温快速扩增方法使用的上游引物与下游引物的序列分别如seq id no.16与seq idno.27所示。

9、在一个优选的实施方案中，步骤（2）所述荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针的结构为fam-uuuuuu-bhq1，即，探针的序列为uuuuuu，fam（羧基荧光素，carboxyfluorescein）标记于探针5’端，bhq1（黑洞淬灭基团1，black hole quencher 1）标记于探针3’端。

10、再其次，本发明提供了一种基于crispr-cas13a和多酶恒温快速扩增技术的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述的crrna分子 ，cas13a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针，t7rna聚合酶，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的序列分别如seq idno.16与seq id no.25、seq id no.16与seq id no.26、seq id no.16与seq id no.27或seq id no.17与seq id no.25所示的上游引物与下游引物。

11、在一个优选的实施方案中，所述crrna分子体外转录模板的序列如seq id no.11所示，所述多酶恒温快速扩增方法使用的上游引物与下游引物的序列分别如seq id no.16与seq id no.27所示。

12、在一个更为优选的实施方案中，所述荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针的结构为fam-uuuuuu-bhq1。

13、最后，本发明提供了一种应用上述的应用所述crrna分子基于非诊断目的的crispr-cas13a技术检测斑点热群立克次体的核酸的方法检测斑点热群立克次体的核酸的装置，所述装置设置有多酶恒温快速扩增模块、crispr-cas13a反应模块和荧光强度检测模块。

14、本发明提供的crispr-cas13a结合多酶恒温快速扩增技术检测斑点热群立克次体的核酸的方法简便易行快速，仅需要提供39℃的反应环境，针对样本核酸仅需一步30分钟即可完成检测，通过简单的荧光读取设备即可判读结果，便于基层的快速检测，适合仪器条件较为简单的卫生机构或疫情现场开展使用。本方法检测斑点热群立克次体的核酸的灵敏度达到1 copy/μl，在与钩端螺旋体、嗜吞噬细胞无形体、恙虫病东方体、伯氏疏螺旋体、嗜血流感杆菌和肺炎链球菌的鉴别检测中，crispr荧光检测sfgr ompa基因阳性质粒的荧光值与其他6种阴性对照相比具有显著差异（p<0.0001），特异性100%。

1. 一种用于crispr-cas13a技术检测斑点热群立克次体的核酸的crrna分子，其特征在于，所述crrna分子的体外转录模板的序列选自seq id no.3、seq id no.7、seq idno.11和seq id no.13中的任一序列。

2.一种应用权利要求1所述crrna分子基于非诊断目的的crispr-cas13a技术检测斑点热群立克次体的核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的样本核酸模板由多酶恒温快速扩增方法制备。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多酶恒温快速扩增方法使用的上游引物与下游引物的序列分别如seq id no.16与seq id no.25、seq id no.16与seq idno.26、seq id no.16与seq id no.27或seq id no.17与seq id no.25所示。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述crrna分子的体外转录模板的序列如seq id no.11所示，所述多酶恒温快速扩增方法使用的上游引物与下游引物的序列分别如seq id no.16与seq id no.27所示。

6.根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针的结构为fam-uuuuuu-bhq1。

7. 一种基于crispr-cas13a和多酶恒温快速扩增技术的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的crrna分子，cas13a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针，t7 rna聚合酶，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的序列分别如seq idno.16与seq id no.25、seq id no.16与seq id no.26、seq id no.16与seq id no.27或seq id no.17与seq id no.25所示的上游引物与下游引物。

8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述crrna分子的体外转录模板的序列如seq id no.11所示，所述多酶恒温快速扩增技术使用的上游引物与下游引物的序列分别如seq id no.16与seq id no.27所示。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针的结构为fam-uuuuuu-bhq1。

10.一种应用权利要求2-5任一所述的方法检测斑点热群立克次体的核酸的装置，其特征在于，所述装置设置有多酶恒温快速扩增模块、crispr-cas13a反应模块和荧光强度检测模块。