一种用于治疗动脉粥样硬化的纳米颗粒及其制备方法和应用

本公开涉及生物医药，尤其涉及一种用于治疗动脉粥样硬化的纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、动脉粥样硬化是冠心病等心血管疾病的重要病理基础，其发生发展与斑块内巨噬细胞介导的炎症反应密切相关。目前临床治疗主要采用调节血脂、抗血小板等药物，可在一定程度上延缓疾病进展，但难以直接作用于斑块炎症微环境。

2、雷帕霉素（rapamycin，rap）可通过调控mtor相关通路影响巨噬细胞自噬和极化状态发挥抗as作用。然而，rap水溶性较差，口服生物利用度有限，且全身应用可造成包括血液、骨髓、胃肠道、皮肤黏膜在内的多系统不良反应，限制了其系统性应用。目前，rap在心血管领域主要以支架药物涂层形式用于局部治疗，其抗as治疗潜力尚未得到充分发挥。

3、纳米药物递送技术可改善难溶性药物的溶解性、稳定性及体内递送特性，并可通过表面修饰靶向配体实现对特定细胞或病变部位的主动靶向。然而，部分纳米递送材料仍存在生物相容性、制备工艺及临床转化等方面的局限。

4、因此，传统技术有待改进。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本公开提供血清白蛋白负载雷帕霉素纳米颗粒及其制备方法和应用。

2、第一方面，本公开提供了一种用于治疗动脉粥样硬化的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括：载体和活性药物；所述载体包裹所述活性药物；

3、所述载体表面通过交联剂偶联有特异性识别巨噬细胞表面sr-aⅰ受体的靶向配体；

4、所述活性药物包括雷帕霉素。

5、本公开中，载体包裹活性药物，利用载体的疏水结合作用增溶难溶性的雷帕霉素，改善雷帕霉素水溶性差的固有缺陷，同时对药物形成物理保护，减少药物在体循环过程中被代谢降解；载体表面借助交联剂共价接枝靶向配体，区别于简单物理混合，可赋予纳米颗粒主动靶向能力。sraⅰ受体高特异性表达于动脉粥样硬化斑块内部泡沫巨噬细胞，是斑块炎症的关键细胞，靶向配体可介导纳米颗粒识别、结合斑块部位巨噬细胞，促使纳米颗粒在动脉粥样硬化病灶处富集，减少药物在正常组织非特异性分布，在源头降低雷帕霉素全身给药带来的骨髓、胃肠道、皮肤黏膜等多系统毒副作用。

6、进一步地，所述靶向配体包括pp1靶向肽；

7、所述pp1靶向肽的其氨基酸序列为leu-ser-leu-glu-arg-phe-leu-arg-cys-trp-ser-asp-ala-pro-ala-lys，如seq id no.1所示。

8、pp1靶向肽能够特异性结合泡沫巨噬细胞表面sr-aⅰ受体，一方面介导纳米颗粒被斑块巨噬细胞内化摄取，实现载体药物复合体向病灶细胞内递送；另一方面该多肽本身具备sraⅰ受体拮抗活性，可以竞争性抑制巨噬细胞通过sraⅰ摄取氧化低密度脂蛋白，在药物发挥作用的同时辅助抑制泡沫细胞继续生成；明确氨基酸序列与序列编号 seq id no.1，为肽的合成、验证以及专利保护边界提供确切物质基础，保证靶向识别功能可重复实现。

9、进一步地，所述交联剂包括马来酰亚胺-聚乙二醇-n-羟基琥珀酰亚胺。

10、该交联剂两端带有不同活性官能团，一端nhs活性酯可以与载体蛋白表面氨基发生反应形成酰胺共价键，另一端马来酰亚胺基团可以和pp1靶向肽上半胱氨酸的巯基发生迈克尔加成形成硫醚共价键，依靠中间peg链作为柔性间隔臂，将pp1靶向肽稳定共价偶联在载体表面；共价偶联方式可以避免体内循环过程中靶向肽从载体表面脱落，保障体内靶向识别的稳定性；同时peg链还可以减少纳米颗粒被网状内皮系统非特异性清除，延长纳米颗粒体内血液循环时间，进一步提升斑块部位富集概率。

11、进一步地，所述载体包括牛血清白蛋白。

12、与现有技术相比，本公开选用牛血清白蛋白作为载体基质，白蛋白分子内部存在大量疏水结构域，可通过疏水相互作用高效包载疏水性雷帕霉素，提升药物载药量；白蛋白生物相容性好，免疫原性低，体内安全性高，降解产物无毒，具备良好的转化潜力；白蛋白纳米颗粒理化性质温和，不会造成包载药物失活，同时白蛋白骨架可改善纳米颗粒的胶体稳定性，减少颗粒聚集沉降。

13、第二方面，本公开提供了上述的用于治疗动脉粥样硬化的纳米颗粒的制备方法，包括下述过程：

14、将所述活性药物的溶液与所述载体溶液接触，形成载体-活性药物体系；

15、对所述载体-活性药物体系纯化、离心，取上清液，冷冻干燥，获得纯化载体-活性药物粉末；

16、将所述纯化载体-活性药物粉末、交联剂、靶向配体接触，经超滤、离心、再次超滤、洗涤后，冷冻干燥获得所述纳米颗粒。

17、与现有技术相比，本公开的纳米颗粒的整体制备流程，分为药物负载、纯化冻干、交联偶联靶向肽、再次纯化冻干四大步骤。先完成药物负载再进行靶向肽共价偶联，可避免靶向肽在药物负载步骤中被有机溶剂dmso破坏失活；通过纯化步骤去除游离的雷帕霉素、游离交联剂、未结合靶向肽，降低体系内杂质干扰；最终冻干处理，大幅提升纳米颗粒储存稳定性，便于保存和后续复溶给药，整套流程条件温和，保护药物与多肽生物活性。

18、进一步地，所述将所述活性药物的溶液与所述载体溶液接触的过程为：将15~25mg/ml雷帕霉素的dmso溶液缓慢滴加至牛血清白蛋白水溶液中，使得牛血清白蛋白与雷帕霉素摩尔比为1:100~150，室温搅拌反应2~8h。

19、与现有技术相比，本公开限定15~25mg/ml的雷帕霉素dmso溶液保证难溶性雷帕霉素充分溶解，缓慢滴加的投料方式，避免局部药物浓度过高造成药物析出团聚；摩尔比控制1:100~150，平衡雷帕霉素载药效率与纳米颗粒胶体稳定性，该摩尔比条件下白蛋白疏水空腔可以充分结合雷帕霉素，同时不会因为药物过载造成纳米颗粒聚集沉淀；室温、搅拌2~8h，条件温和，既保证疏水相互作用充分发生完成药物包载，又避免高温造成雷帕霉素以及白蛋白蛋白变性失活。

20、应理解，本公开中的室温并非固定的温度，而是指对应季节下，室内的温度。

21、进一步地，对所述载体-活性药物体系纯化采用3000da透析袋对反应液进行透析纯化，前2~3h每小时换水1~2次，随后每1~2h换水一次，共透析15~20h。

22、采用3000da透析袋进行纯化，透析截留分子量小于白蛋白雷帕霉素复合物分子量，可以截留纳米复合物，将未被白蛋白包载的游离雷帕霉素、有机溶剂dmso小分子扩散透出除去；分阶段更换透析外液，前期高频率换水快速去除高浓度dmso与游离药物，后期降低换水频率持续深度纯化；总透析时间15~20h，在充分去除小分子杂质同时，防止透析时间过长造成部分包载的雷帕霉素从白蛋白上泄露脱落，保障载药体系纯度与载药水平。

23、进一步地，透析结束后于0~5℃、3000~5000rpm离心30~80min；取上清液液氮速冻后冷冻干燥2~5d，获得纯化载体-活性药物粉末。

24、0~5℃低温离心，在去除大颗粒蛋白聚集体的同时，低温条件可以抑制雷帕霉素降解以及白蛋白变性；取上清舍弃沉淀，除去制备过程产生的大颗粒团聚物，保证后续偶联反应原料为单分散的载体药物复合体；液氮速冻可以快速形成细小冰晶，减少纳米颗粒在冻结过程中发生颗粒融合聚集；冷冻干燥2~5d，充分去除溶剂水，得到固态粉末，显著提升载体药物中间体的长期储存稳定性，便于后续偶联靶向肽操作。

25、进一步地，将所述纯化载体-活性药物粉末、交联剂、靶向配体接触的过程为：

26、取pp1肽、纯化载体-活性药物粉末及马来酰亚胺-聚乙二醇-n-羟基琥珀酰亚胺分别溶于pbs缓冲液中，获得pp1肽溶液、纯化载体-活性药物溶液和马来酰亚胺-聚乙二醇-n-羟基琥珀酰亚胺溶液；

27、将所述马来酰亚胺-聚乙二醇-n-羟基琥珀酰亚胺溶液加入到所述纯化载体-活性药物溶液，马来酰亚胺-pegnhs与载体活性药物反应30~60min后，用50kda分子量截留的超滤离心管对反应体系进行纯化，以ph7.4的pbs缓冲液作为洗涤液，于0~4℃条件下，3000~5000rpm离心1020min，超滤洗涤2~3次，去除未反应的交联剂。然后加入pp1肽溶液进行偶联反应2~5h后，再次采用上述超滤条件洗涤23次，除去游离多肽。收集纯化后的纳米颗粒悬液，于80℃预冻48h，在冷阱温度50~55℃、真空条件下冷冻干燥24~48h，得到纳米粒冻干粉末。

28、本公开ph7.4 pbs缓冲水溶液可以维持蛋白、多肽活性，避免有机溶剂破坏pp1肽与白蛋白结构；先让交联剂malpegnhs和白蛋白载体反应，使载体表面带上活化马来酰亚胺基团，超滤洗涤除去过量未反应交联剂，避免多余交联剂后续直接与 pp1 肽发生分子间交联产生副产物；之后再投入pp1靶向肽发生巯基马来酰亚胺加成，实现靶向肽定向接枝；选用50kda超滤管，截留纳米颗粒复合体，透过除去小分子游离交联剂、未偶联游离pp1肽；全程0~4℃低温离心，降低蛋白、多肽降解风险；80℃预冻配合50~55 ℃冷阱真空冻干，实现终产品纳米颗粒粉末制备，既保留纳米颗粒原有粒径、分散性、靶向生物活性，又方便储存、运输，给药前仅需加水复溶即可使用，整套工艺可控，可重复性强。

29、第三方面，本公开提供了上述的用于治疗动脉粥样硬化的纳米颗粒或上述的方法制备到的纳米颗粒在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

30、进一步地，纳米颗粒通过调控mtor相关通路影响巨噬细胞自噬及极化，改善斑块局部炎性微环境，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。

31、纳米颗粒作为药物活性组分，依靠载体包裹实现雷帕霉素增溶，依靠pp1靶向肽介导向动脉粥样硬化斑块巨噬细胞靶向富集，克服游离雷帕霉素难以全身给药治疗动脉粥样硬化的缺陷，将本纳米颗粒应用于制备抗动脉粥样硬化药物，拓展雷帕霉素系统性治疗动脉粥样硬化的实际应用场景。

32、纳米颗粒经pp1-sr-aⅰ介导被斑块内m1型促炎巨噬细胞摄取之后，在细胞内释放活性药物雷帕霉素；雷帕霉素抑制mtor信号通路，上调巨噬细胞自噬水平，同时调控巨噬细胞极化状态，促使促炎 m1型巨噬细胞向抗炎m2型巨噬细胞转换；由此降低斑块局部促炎因子释放，减轻斑块炎症反应，抑制泡沫细胞持续累积，稳定动脉粥样硬化斑块，最终实现干预动脉粥样硬化疾病进展的治疗效果。

33、经由上述方案可知，本公开至少达到了如下技术效果：

34、本公开通过牛血清白蛋白纳米颗粒对雷帕霉素的疏水包载，有效解决了雷帕霉素水溶性差、难以全身给药的固有缺陷，同时利用载体骨架对药物的物理保护作用，减少了雷帕霉素在体循环中的降解与全身毒副作用；在此基础上，本公开借助马来酰亚胺-聚乙二醇-n-羟基琥珀酰亚胺异双功能交联剂，将pp1靶向肽通过酰胺键与硫醚键共价偶联于载体表面，借助pp1靶向肽对巨噬细胞表面sr-aⅰ受体的特异性识别能力，实现了纳米颗粒对动脉粥样硬化斑块部位泡沫巨噬细胞的主动靶向富集与内化递送，显著降低了药物在正常组织的非特异性分布，为雷帕霉素用于动脉粥样硬化的系统性治疗提供了安全、高效的药物递送平台。

35、本公开的纳米颗粒经靶向递送进入斑块巨噬细胞后，通过细胞内释放雷帕霉素抑制mtor信号通路，上调巨噬细胞自噬水平并调控巨噬细胞极化状态，促进促炎m1型巨噬细胞向抗炎m2型巨噬细胞转化，进而降低斑块局部促炎因子释放、抑制泡沫细胞持续累积、改善斑块局部炎性微环境并稳定动脉粥样硬化斑块，最终实现干预动脉粥样硬化疾病进展的显著治疗效果。同时，本公开制备方法全程条件温和、工艺可控、可重复性强，所得纳米颗粒粒径均一、稳定性好、冻干后可长期保存，具备良好的临床转化与应用前景。