一种绞股蓝外泌体样纳米囊泡及其制备方法与在抗动脉粥样硬化药物中的应用与流程

本发明涉及生物医药及天然药物处理，尤其是一种绞股蓝外泌体样纳米囊泡(gelnvs)及其制备方法与在抗动脉粥样硬化药物中的应用。

背景技术：

1、动脉粥样硬化（atherosclerosis, as）是一种以脂质代谢障碍和慢性血管炎症为特征的心血管疾病，是引发冠心病、心肌梗死和缺血性脑卒中等严重急性心脑血管事件的主要病理基础。在as的发生发展过程中，血管内皮损伤、脂质沉积以及巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白（ox-ldl）后形成大量脂质蓄积的“泡沫细胞”，是导致斑块形成和破裂的关键驱动因素。目前，临床上针对动脉粥样硬化的首选治疗药物主要为以他汀类为代表的降脂化学药。然而，现有的化学合成药物存在显著局限性：一方面，药物在体内分布广泛，缺乏对动脉斑块病变部位的特异性靶向作用，导致病灶局部药物浓度不足；另一方面，长期服用他汀类药物常伴随明显的毒副作用，包括肝肾功能异常、横纹肌溶解以及胃肠道不良反应。

2、因此，寻找毒副反应小、具有病灶靶向特性的天然药物或新型给药系统，已成为心血管疾病治疗领域迫切需要解决的现实需求。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明实施例提供了一种绞股蓝外泌体样纳米囊泡的制备方法，该方法条件温和、易于规模化量产。

2、本发明实施例还提供了上述方法制得的绞股蓝外泌体样纳米囊泡。

3、本发明实施例还提供了绞股蓝外泌体样纳米囊泡在抗动脉粥样硬化药物中的应用。

4、根据本发明的一个方面，提供了一种绞股蓝外泌体样纳米囊泡的制备方法，包括如下步骤：

5、s1、取绞股蓝加入复合酶解液混合，破碎后酶解，过滤后经多级梯度差速离心除杂后经初滤，得粗滤液；其中，所述复合酶液包括纤维素酶与果胶酶；所述多级梯度差速离心至少包括三级梯度差速离心，一级离心速度为900×g~1100×g；二级离心速度为2800×g~3200×g；三级离心速度为9000×g~11000×g；一级离心、二级离心和三级离心的时间依次延长；

6、s2、将所述粗滤液与聚乙二醇混合，3~6℃下孵育富集，得混合液；

7、s3、将所述混合液离心收集沉淀，滤膜除菌除杂后，超滤脱杂纯化，即得。

8、根据本发明的一些实施方式，所述复合酶液中纤维素酶与果胶酶的质量比为1：0.9~1.1。如为1：1等。

9、根据本发明的一些实施方式，所述复合酶液中纤维素酶质量浓度为0.05~0.4%。

10、根据本发明的一些实施方式，所述复合酶液与绞股蓝原料质量之比为1：1~3。如为1：2。

11、根据本发明的一些实施方式，所述酶解温度为1~6℃。

12、根据本发明的一些实施方式，所述酶解时间为6~14h。如为8h、10h或12h等。

13、根据本发明的一些实施方式，所述过滤用的滤袋的孔径为80~120目。如为100目。

14、根据本发明的一些实施方式，所述一级离心、二级离心和三级离心的时间之比为1：1.8~2.2：2.8~3.2。

15、根据本发明的一些实施方式，所述一级离心时间为8~12min。

16、根据本发明的一些实施方式，所述多级梯度差速离心中离心在2~8℃下进行。如为4℃。

17、根据本发明的一些实施方式，所述初滤用的滤膜孔径为20~60μm。

18、根据本发明的一些实施方式，所述聚乙二醇（peg）包括peg6000~10000。

19、根据本发明的一些实施方式，所述聚乙二醇（peg）包括peg 6000、peg8000和peg10000。

20、根据本发明的一些实施方式，所述聚乙二醇的质量加入量与粗滤液的体积加入量比值为5~10% g/ml。

21、根据本发明的一些实施方式，所述孵育时间为8~14h。如为12h。

22、根据本发明的一些实施方式，所述步骤s3中离心操作包括在8000×g~12000×g离心（优选地，温度为2~8℃）20~40min，取上清。

23、根据本发明的一些实施方式，所述除菌操作包括以pbs缓冲液重悬，依次经0.45μm、0.22μm滤膜过滤除菌。

24、根据本发明的一些实施方式，所述超滤采用的是100kda超滤管超滤。采用 100kda 超滤管浓缩，去除 peg 及小分子杂质，获得高纯度gelnvs悬液。

25、根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括在与复合酶液混合前对绞股蓝进行粉碎处理。

26、根据本发明的一些实施方式，所述破碎包括榨汁处理。

27、根据本发明的另一方面，提供了上述方法制得的绞股蓝外泌体样纳米囊泡。

28、根据本发明的一些实施方式，所述绞股蓝外泌体样纳米囊泡的分布于 55-150nm，zeta 电位约为 -35.87 ± 1.10 mv。

29、根据本发明的再一方面，提供了一种绞股蓝外泌体样纳米囊泡制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

30、根据本发明的一些实施方式，所述抗动脉粥样硬化包括预防、改善或治疗动脉粥样硬化。

31、根据本发明的一些实施方式，所述绞股蓝外泌体样纳米囊泡通过上述方法制备得到。

32、根据本发明的一些实施方式，所述绞股蓝外泌体样纳米囊泡通过如下方式中的至少一种发挥抗动脉粥样硬化作用：1）降低促炎因子水平；2）抑制巨噬细胞脂质蓄积；3）抑制巨噬细胞泡沫化；4）减轻血管斑块沉积。

33、根据本发明的又一方面，提供了一种抗动脉粥样硬化的药物组合物，所述药物组合物包括含上述绞股蓝外泌体样纳米囊泡的抗动脉粥样硬化药物。

34、本发明至少包括以下有益效果：

35、本发明巧妙地采用peg聚合物沉淀+超滤法替代传统的超速离心法，极大地降低了对仪器设备的硬件要求（常规高速冷冻离心机即可实现）和生产成本。整个提取过程在温和条件（4℃）下进行，最大限度保留了绞股蓝囊泡内源性核酸和蛋白质的生物活性，提取纯度高、收率大，极具工业化推广和量产前景。本发明首次证实了gelnvs在抗心血管疾病中的药用价值，其具有多维靶向并能高效抗粥样硬化。体外与体内实验表明，该外泌体能够被巨噬细胞高效摄取，有效逆转模型组胆固醇（ce/tc比值）的升高趋势，显著抑制氧化低密度脂蛋白（ox-ldl）诱导的巨噬细胞脂质蓄积与泡沫化过程，其药效甚至优于临床一线化学药阿托伐他汀，为靶向干预和治疗动脉粥样硬化提供了一种极具潜力的天然纳米药物新策略。

1.一种绞股蓝外泌体样纳米囊泡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的绞股蓝外泌体样纳米囊泡的制备方法，其特征在于：所述复合酶液与绞股蓝原料质量之比为1：1~3。

3.根据权利要求1所述的绞股蓝外泌体样纳米囊泡的制备方法，其特征在于：所述一级离心、二级离心和三级离心的时间之比为1：1.8~2.2：2.8~3.2。

4.根据权利要求1所述的绞股蓝外泌体样纳米囊泡的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇包括peg6000~10000。

5.根据权利要求1所述的绞股蓝外泌体样纳米囊泡的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇的质量加入量与粗滤液的体积加入量比值为5~10% g/ml。

6.根据权利要求1至5任一项所述的绞股蓝外泌体样纳米囊泡的制备方法制得的绞股蓝外泌体样纳米囊泡。

7.一种绞股蓝外泌体样纳米囊泡制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述绞股蓝外泌体样纳米囊泡通过如权利要求1至5任一项所述方法制备得到。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述绞股蓝外泌体样纳米囊泡通过如下方式中的至少一种发挥抗动脉粥样硬化作用：1）降低促炎因子水平；2）抑制巨噬细胞脂质蓄积；3）抑制巨噬细胞泡沫化；4）减轻血管斑块沉积。

10.一种抗动脉粥样硬化的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括含如权利要求1至5任一项所述的制备方法制得的绞股蓝外泌体样纳米囊泡的抗动脉粥样硬化药物。