靶向脾脏的mRNA纳米颗粒在制备免疫激活药物中的应用

本发明涉及生物医药，尤其是指靶向脾脏的mrna纳米颗粒在制备免疫激活药物中的应用。

背景技术：

1、t细胞重定向治疗是当前肿瘤免疫治疗的重要方向，其通过人工设计的抗原识别或免疫桥联分子，介导t细胞特异性识别并杀伤表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞。目前代表性技术包括嵌合抗原受体t细胞（car-t）治疗、双特异性t细胞衔接蛋白治疗等工程化免疫分子技术，上述技术在血液系统肿瘤中已显示出重要应用价值，并逐渐向实体瘤治疗拓展。

2、然而，现有t细胞重定向治疗仍存在一定局限，极大限制了其治疗效果与临床应用安全性。其中，car-t细胞治疗依赖体外t细胞分离、基因修饰、大规模扩增、质控及体内回输的复杂制备流程，存在制备周期长、工艺复杂、生产成本高昂的问题，同时细胞产品批次一致性差、回输后体内扩增行为不可控等问题。蛋白类双特异性t细胞衔接器虽无需体外细胞改造与制备，但该类蛋白需通过持续、反复的全身性给药维持体内有效药物浓度与靶受体占位，易引发全身广泛性t细胞异常激活，诱发严重细胞因子释放综合征等毒副作用，从而限制治疗窗口。

3、mrna药物与纳米递送技术的快速发展，为实现体内原位表达治疗性免疫调控蛋白、规避传统细胞治疗与蛋白药物的缺陷提供了一种新的技术路线。通过脂质纳米颗粒等递送载体，可将编码t细胞重定向功能蛋白的mrna递送至体内并实现原位表达，有望实现内源性t细胞的体内重定向编程。但目前主流的脂质纳米颗粒递送体系经静脉给药后存在明显的肝脏富集倾向，使得目的治疗蛋白主要在肝脏部位表达。然而，肝脏并非t细胞自然活化、扩增和功能编程的主要场所，无法充分利用脾脏等次级淋巴器官免疫细胞高度富集、免疫应答有序发生的生理微环境，难以实现高效、特异性的t细胞原位重定向与功能激活，无法充分发挥mrna体内表达技术的应用潜力。

4、综上，现有技术的缺陷为：研究重点多聚焦于优化t细胞重定向分子结构、提升药物递送效率，缺乏将治疗分子表达位点与t细胞天然免疫编程微环境精准匹配的技术方案。当前领域尚无能够规避复杂体外细胞制备流程、降低全身性药物暴露毒性，同时依托脾脏等次级淋巴器官优势微环境，高效、可控地实现内源性t细胞肿瘤重定向功能重塑的核酸治疗策略。因此，本领域亟需开发一种新型的免疫器官靶向核酸递送与原位表达技术体系，以兼顾肿瘤免疫治疗的有效性、安全性与可及性。

技术实现思路

1、为了解决现有t细胞重定向治疗依赖体外细胞工程、蛋白t细胞衔接器系统暴露高、以及常规mrna递送体系表达部位与t细胞自然编程场所不匹配等问题，本发明提供了靶向脾脏的mrna纳米颗粒在制备免疫激活药物中的应用。本发明通过体内递送核酸分子，在免疫器官内原位表达t细胞重定向分子，从而实现内源性t细胞体内编程的系统及其应用。使编码t细胞重定向分子的核酸药物能够在体内优先进入脾脏等免疫器官，并在该类器官内原位表达功能性免疫调节蛋白，从而在体内赋予内源性t细胞肿瘤识别、重定向杀伤和免疫效应增强能力。

2、通过该技术方案，有望在不依赖体外细胞工程操作、不维持高水平系统游离蛋白暴露的情况下，提高t细胞重定向效率，增强抗肿瘤免疫效应，并改善疗效与系统毒性之间的平衡。

3、本发明通过以下技术方案实现：

4、本发明的目的是提供一种靶向脾脏的mrna纳米颗粒在制备免疫激活药物中的应用，所述编码t细胞重定向分子的mrna纳米颗粒通过将编码t细胞重定向分子的mrna与聚合物混合制备得到。

5、进一步地，所述聚合物为含有环状二硫基团修饰的阳离子聚合物pei。

6、进一步地，所述聚合物的结构如下所示：

7、。

8、进一步地，所述编码t细胞重定向分子的mrna与所述聚合物的添加质量比为1:2~1:100。

9、进一步地，所述编码t细胞重定向分子的mrna纳米颗粒的粒径为20 nm~300 nm。

10、进一步地，所述编码t细胞重定向分子的mrna纳米颗粒的剂量为0.20 mg/kg~0.30mg/kg。

11、进一步地，所述编码t细胞重定向分子的mrna纳米颗粒的使用频率为每隔1~3天一次，连续1~3次。

12、进一步地，所述药物的剂型为注射剂。

13、进一步地，所述药物还包括与免疫检查点抑制剂、化疗药物、细胞因子、肿瘤疫苗或溶瘤病毒联用；或配合放疗使用。

14、进一步地，所述药物还包括药学上或药理上可接受的载体和/或盐。

15、相较于传统car-t细胞治疗、蛋白形式t细胞衔接器系统给药以及常规肝脏趋向性mrna递送方案，本发明能够在效应分子表达部位、t细胞体内武装效率、抗肿瘤疗效和系统安全性之间形成更优的综合平衡，具有以下有益效果：

16、首先，本发明能够在体内实现内源性t细胞的原位编程，避免传统car-t细胞治疗中体外分离、基因修饰、扩增、质控和回输等复杂细胞制备流程。通过将编码t细胞重定向分子的核酸递送至脾脏等免疫器官，本发明可在体内直接生成具有肿瘤重定向能力的t细胞，从而提高治疗便利性、可重复性和临床转化潜力。

17、其次，本发明能够提高t细胞重定向分子的空间利用效率。与常规lnp递送mrna后主要在肝脏表达治疗蛋白不同，本发明使编码t细胞重定向分子的核酸优先在脾脏等免疫器官内表达，使治疗蛋白的产生部位更接近t细胞自然活化、增殖和功能塑造的生理环境。实验结果显示，在体内给药后，脾脏中tce+t细胞比例呈剂量依赖性升高，在优选给药剂量下可达到脾脏t细胞的20%以上，说明本发明能够在免疫器官内有效形成较高比例的功能性重定向t细胞群体。

18、再次，本发明能够增强t细胞的抗原依赖性杀伤功能。经本发明系统处理后形成的t细胞能够识别表达相应靶抗原的肿瘤细胞，并诱导细胞毒性效应分子释放，从而实现对靶细胞的特异性杀伤。在体外功能验证中，来源于本发明处理小鼠的脾脏t细胞对抗原阳性靶细胞表现出更强的细胞毒活性，优于蛋白t细胞衔接器组和常规lnp-mrna递送组，说明本发明能够产生可在局部免疫器官外继续发挥作用的效应t细胞。

19、进一步地，本发明能够显著提高体内抗肿瘤疗效。在实体瘤模型中，本发明处理组表现出稳定、持续的肿瘤生长抑制作用，终点肿瘤质量或肿瘤负荷相较对照组降低约70%。同时，个体肿瘤生长曲线显示，本发明处理组小鼠间疗效更为一致，提示以脾脏为中心的体内t细胞编程能够更稳定地产生抗肿瘤效应来源，而非依赖肿瘤局部随机摄取纳米制剂。

20、此外，本发明具有良好的联合治疗应用潜力。在与局部放疗联合应用时，本发明可进一步增强抗肿瘤效果，在优选实施例中可观察到部分动物达到完全缓解，例如6只动物中4只出现完全缓解，说明本发明不仅可以作为单独免疫治疗方案使用，也可以作为放疗、免疫检查点抑制剂、化疗或其他抗肿瘤治疗的联合增强策略。

21、最后，本发明能够改善疗效与安全性之间的平衡。与蛋白形式t细胞衔接器系统给药相比，本发明通过在脾脏等免疫器官内局部产生t细胞重定向分子，可减少体内游离蛋白的系统性暴露，从而降低广泛t细胞激活和细胞因子相关毒性风险。实验结果显示，本发明处理后系统性细胞因子水平总体呈适度升高，而未出现蛋白t细胞衔接器组所见的过高细胞因子反应；同时小鼠体重无明显下降，血清alt、ast和尿素等肝肾功能指标保持在正常范围内，主要脏器组织学检查未见明显损伤，说明本发明在保持抗肿瘤疗效的同时具有较好的系统安全性。

22、综上，本发明通过将t细胞重定向分子的体内产生部位由外周循环或肝脏偏向表达转变为脾脏等免疫器官内原位表达，实现了以免疫器官为中心的体内t细胞编程。该技术方案能够在避免复杂体外细胞工程操作的同时，提高t细胞武装效率、增强抗肿瘤疗效、降低系统性炎症和器官毒性风险，具有良好的治疗指数和临床转化前景。