外泌体水凝胶及其制备方法和用途与流程

本申请实施例涉及生物医用材料，具体涉及一种外泌体水凝胶及其制备方法和用途。

背景技术：

1、慢性伤口通常是指4周或更长时间内未被治愈的皮肤屏障缺损，它不经历典型的伤口修复阶段，而是陷入炎症阶段，并进入炎症和组织破坏的恶性循环。慢性伤口作为皮肤伤口领域的典型案例备受研究者和医护人员的广泛关注。

2、目前，用作伤口敷料的水凝胶已成为伤口愈合的有效手段。水凝胶不仅建立了有利于调节免疫反应的抗炎环境，而且还可以提高外泌体稳定性，控制和持续释放外泌体。然而，传统的水凝胶性能较差，如缺乏组织黏附性，机械性能、降解性能不理想，没有自愈能力，限制了其生物医学应用。近年来，人们越来越关注刺激响应水凝胶，因为它们可以在外部刺激(包括温度、ph、ros和葡萄糖)的影响下进行调节。考虑到慢性伤口(如糖尿病伤口)处高ros和高葡萄糖的微环境，开发一种微环境响应型水凝胶被认为是有效的策略。

技术实现思路

1、本申请实施例的目的在于提供了一种外泌体水凝胶及其制备方法和用途。

2、为实现上述目的，本申请实施例提出以下技术方案：

3、第一方面，本申请实施例提供了一种外泌体水凝胶，所述外泌体水凝胶由外泌体、氧化透明质酸和羧甲基壳聚糖经过交联制得；

4、其中，所述外泌体水凝胶中，所述外泌体的终浓度为20-5000μg/ml，氧化透明质酸的终浓度为1-200mg/ml，羧甲基壳聚糖的终浓度为10-500mg/ml。

5、作为一种实施方式，所述外泌体的制备方法，包括：

6、配置含培养液的细胞培养基，所述培养液包括微量元素；

7、将人脐带间充质干细胞置于细胞培养基中，得到含有人脐带间充质干细胞的细胞培养基；

8、采用3d生物反应器对含有人脐带间充质干细胞的细胞培养基进行3d培养，收集上清液；

9、上清液经差速离心后，得到人脐带间充质干细胞外泌体。

10、作为一种实施方式，所述配置含培养液的细胞培养基，包括：

11、取矿石粉末，溶于溶解液中，得到混合液；

12、混合液过滤后，加入交变强磁场中，在交变强磁场中经剪切、陈化、过滤、净化后，得到金属离子溶液；

13、采用稀释液稀释金属离子溶液，得到稀释后的金属离子溶液；

14、对稀释后的金属离子溶液进行灭菌、过滤后，得到培养液；

15、将培养液滴加到细胞培养基中，得到含培养液的细胞培养基；

16、其中，所述矿石粉末选自锌矿石粉、云母粉、蛭石粉、煤矿石粉、天青石粉、麦饭石粉中的至少一种。

17、作为一种实施方式，所述溶解液为稀盐酸、稀硫酸和草酸的混合溶液；所述稀盐酸、稀硫酸和草酸的体积比为3:5:2；

18、所述稀释液为0.9％氯化钠溶液；所述交变强磁场的磁场强度为1×103～4高斯。

19、作为一种实施方式，所述上清液经差速离心后，得到人脐带间充质干细胞外泌体，包括：

20、将上清液先使用300×g的离心力在室温下离心10-15min；

21、将上一步离心后的上清液使用2000×g的离心速度，在室温下离心20-30min；再使用10000×g的离心速度，4℃条件下离心20-30min，过滤得到人脐带间充质干细胞外泌体。

22、作为一种实施方式，所述氧化透明质酸的氧化度为5％-50％，优选氧化度为20％-40％。

23、作为一种实施方式，所述微量元素选自铁、镁、锌、锰、钛、钙、硒、钒、铬、镍、钴、钼、铜、钾中的至少一种；所述3d生物反应器为3d flotrix minispin生物反应器。

24、作为一种实施方式，所述外泌体水凝胶中，所述外泌体的终浓度为30-2500μg/ml，氧化透明质酸的终浓度为25-75mg/ml，羧甲基壳聚糖的终浓度为75-300mg/ml。

25、第二方面，本申请实施例提出一种如第一方面所述的外泌体水凝胶的制备方法，所述制备方法包括：

26、将羧甲基壳聚糖溶于pbs溶液中，得到羧甲基壳聚糖pbs溶液；

27、将氧化透明质酸溶于pbs溶液中，得到氧化透明质酸pbs溶液；

28、将外泌体均匀分散于羧甲基壳聚糖pbs溶液中，得到混合液；

29、将混合液与氧化透明质酸pbs溶液混合均匀，得到外泌体水凝胶。

30、第三方面，本申请实施例提出如第一方面所述的外泌体水凝胶在制备用于治疗或加速慢性伤口愈合的敷料中的用途。

31、本申请实施例至少具有以下有益效果：

32、本申请实施例采用含微量元素的细胞培养基，并结合3d培养对人脐带间充质干细胞进行培养；其中，含微量元素的3d培养改变了干细胞的生存环境，降低了干细胞中的细胞骨架张力，增加了多种基因的表达，影响了干细胞分化状态，实现在最小的培养基体积中产生高浓度、高活性的外泌体。同时，除了培养环境的物理和机械变化外，含微量元素的3d培养还会影响干细胞整体缺氧状态，这改变了外泌体内蛋白和核酸等物质的含量。这种携微量元素的外泌体参与细胞间和细胞间微环境的调控，调节免疫环境，控制炎症相关基因的表达，提高外泌体抗炎活性。

33、本申请实施例基于制备得到的外泌体，通过氧化透明质酸、羧甲基壳聚糖和外泌体交联制得的水凝胶。该水凝胶具有可注射、黏附性、自愈合性、ros/葡萄糖响应型，以及优异的机械性能，提示其可用于加速慢性伤口的愈合。

34、本申请附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

1.一种外泌体水凝胶，其特征在于，所述外泌体水凝胶由外泌体、氧化透明质酸和羧甲基壳聚糖经过交联制得；

2.根据权利要求1所述的外泌体水凝胶，其特征在于，所述外泌体的制备方法，包括：

3.根据权利要求2所述的外泌体水凝胶，其特征在于，所述配置含培养液的细胞培养基，包括：

4.根据权利要求3所述的外泌体水凝胶，其特征在于，所述溶解液为稀盐酸、稀硫酸和草酸的混合溶液；所述稀盐酸、稀硫酸和草酸的体积比为3:5:2；

5.根据权利要求1所述的外泌体水凝胶，其特征在于，所述上清液经差速离心后，得到人脐带间充质干细胞外泌体，包括：

6.根据权利要求1所述的外泌体水凝胶，其特征在于，所述氧化透明质酸的氧化度为5％-50％，优选氧化度为20％-40％。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微量元素选自铁、镁、锌、锰、钛、钙、硒、钒、铬、镍、钴、钼、铜、钾中的至少一种；所述3d生物反应器为3d flotrix minispin生物反应器。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述外泌体水凝胶中，所述外泌体的终浓度为30-2500μg/ml，氧化透明质酸的终浓度为25-75mg/ml，羧甲基壳聚糖的终浓度为75-300mg/ml。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的外泌体水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

10.根据权利要求1-8任一项所述的外泌体水凝胶在制备用于治疗或加速慢性伤口愈合的敷料中的用途。