一种蛋白质移码突变双模态检测方法与流程

本发明涉及生物检测，尤其涉及一种蛋白移码突变双模态检测方法。

背景技术：

1、hist1h1e综合征(hist1h1e syndrome)，也称为rahman综合征，是一种罕见的遗传性疾病[1-4]。hist1h1e综合征的临床表现较为多样，患者通常具有一些典型的面部特征，例如高额头、眼距宽、鼻梁扁平和嘴巴小，五官的发育可能会有明显异常。大部分患者存在轻度到重度的智力障碍，这会对他们的日常生活和学习能力产生影响。发育迟缓也是此病的一个常见症状，患者通常表现出智力发育和运动发育的迟缓，可能出现学习困难、言语发育迟缓和运动协调问题。许多患者身材较为矮小，即使在青春期后期仍然比同龄人身材矮小。其他体征可能包括皮肤松弛、细长的手指和脚趾，有些患者还可能表现出肥胖或肌肉无力等症状。在心理和行为方面，一些患者还会表现出多动行为或情绪波动等问题。

2、针对hist1h1e综合征的研究目前还处在初步阶段，尤其是对于组蛋白h1.4突变如何导致具体的临床症状，科学家们还在深入探索中。这个疾病由hist1h1e基因的杂合体变异引起，hist1h1e基因负责编码组蛋白h1.4，这是一种维持染色质结构和稳定性、调节基因表达的关键蛋白[5]。hist1h1e基因的突变会导致组蛋白h1.4的结构异常，使得染色质的结构和功能受到影响，进而影响基因表达的调控[6-7]。

3、迄今已报道的hist1h1e综合征患儿携带21种移码突变，均位于h1e ctd结构域的99-bp区域内。其中，20种突变新产生含相同38个氨基酸的c端截短突变蛋白。在唯一一例中枢性睡眠呼吸暂停症的病人中，新形成25个氨基酸序列[4]。与野生型蛋白相比，移码突变的h1e c端氨基酸序列净正电荷大量减少，新产生的38个氨基酸序列(下文简称：38aa)能否对h1压缩染色质的功能产生影响，或者导致功能获得(gain-of-function，gof)是重要的科学问题。

4、由于移码产物具有相同的c末端，这使得这些突变蛋白的序列非常相似。想要进一步研究该疾病的机制，蛋白质的功能研究不可或缺，亟需一种高效的检测方法能在同一体系中区分不同的h1.4移码突变体。

5、目前针对蛋白质的检测方法多种多样，首先是edman降解法，这是一种经典的化学方法，用于逐步从蛋白质或肽的n末端切割氨基酸并测定序列。edman降解的优点在于其高精度和可靠性，适合分析短肽或小分子的氨基酸序列，并且不需要依赖已知的数据库，可以用于完全未知的序列测定。然而，它的不足之处在于测序长度有限，一般只能测定40-60个氨基酸以内的序列，而且操作过程复杂，耗时较长。另外，edman降解难以识别蛋白质的翻译后修饰(如磷酸化、甲基化等)，限制了其在现代蛋白质组学中的应用。

6、质谱法是现代蛋白质组学中非常重要的技术，特别是串联质谱(ms/ms)，可以通过将蛋白质酶解为肽段后分析其质量以确定氨基酸序列。质谱法具有高灵敏度和高通量的优点，可以同时分析混合物中的多个蛋白质片段，非常适合复杂样品。质谱法还能够识别蛋白质的翻译后修饰，这在研究蛋白质功能和生物活性方面具有重要意义。然而，质谱法通常需要依赖已知的序列数据库，如果目标蛋白未收录在数据库中，识别会比较困难。此外，质谱法通常只能获得肽段的碎片化序列，难以直接拼接出完整的蛋白质序列。质谱仪器成本高，维护费用大，并且操作需要专业人员，这在一定程度上限制了它的普及。

7、de novo测序也是一种基于质谱的测序方法，但与常规质谱不同，de novo测序不依赖数据库，可用于完全未知的蛋白质序列推测。它通过质谱产生的肽段碎片谱图来推测氨基酸排列。de novo测序适用于不在数据库中的新蛋白质，并且可以识别蛋白质的翻译后修饰，推测蛋白质的功能。然而，de novo测序算法复杂，对计算能力要求高，数据处理过程耗时较长。在遇到存在重复序列或结构修饰的蛋白质时，序列重构也较为困难。

8、氨基酸分析法是一种针对蛋白质水解后得到的氨基酸组成进行分析的方法。这种方法适用于简单的组成分析，帮助了解蛋白质的总体特性，可以检测混合物中不同蛋白质的氨基酸组成。氨基酸分析法的优点是成本相对低，操作也比较简单。然而，氨基酸分析法无法获得具体的氨基酸排列顺序，仅适用于分析氨基酸组成，不适合结构复杂或翻译后修饰丰富的蛋白质。同时，该方法对样品有破坏性，无法获得蛋白质的原始序列信息。

9、综上不难发现，针对组蛋白h1.4突变的检测应用，目前基于edman降解法以及基于质谱法的蛋白质测序方法等方法存在测序通量低、成本高、准确率有限等不足。

技术实现思路

1、为了解决这一问题，本发明提供了一种基于生物纳米孔的分析物检测方法，解决了现有技术中存在的测序通量低、成本高、准确率有限的问题。

2、本发明一方面，提供一种蛋白质移码突变双模态检测方法，包括如下步骤：1)在包括膜和插入膜的单个纳米孔蛋白的生物纳米孔芯片两侧施加不同方向的电压，产生待分析物在生物纳米孔内基于电渗流效应和电泳效应的迁移；2)测量分析物在所述生物纳米孔迁移时产生的离子电流以提供电流信号模式；3)通过电渗流和电泳效应引发的电流信号模式来识别和区分不同种类的分析物。

3、本发明一实施方式中，施加正向电压，获取电渗流效应下的电流信号模式；优选地，正向电压范围为40mv-140mv。

4、本发明一实施方式中，施加负向电压，获取电泳效应下的电流信号模式；优选地，负向电压范围为-140mv-40mv。

5、本发明一实施方式中，对所述电流信号模式分析获得的参数包括amp.s.d、interevent intervals(ton)、δexclude(δi/i0*100％)与dwell time。

6、本发明一实施方式中，通过分析电渗流和电泳效应引发的电流信号模式来识别和区分分析物；优选地，分析电渗流引发的电流信号模式的至少一个参数和电泳效应引发的电流信号模式的至少一个参数；进一步优选地，分析电泳效应下的阻塞电流的波动范围amp.s.d以及电渗流效应下阻塞电流的停留时间dwell time两个参数。

7、本发明一实施方式中，所述纳米孔为mspa同源物或其突变体，优选为m2 mspa纳米孔。

8、本发明一实施方式中，所述分析物为蛋白质及其一个或多个突变体，其中至少一个突变体为移码突变体。

9、本发明一实施方式中，所述分析物包括连接组蛋白h1.4及其突变体。本发明一实施方式中，所述连接组蛋白h1.4突变体包括与连接组蛋白h1.4具有至少50％、60％、70％、80％、90％同一性的序列。本发明一实施方式中，所述连接组蛋白h1.4突变体包括连接组蛋白h1.4的c端截短突变蛋白、连接组蛋白h1.4的融合蛋白。

10、本发明一实施方式中，所述连接组蛋白h1.4(h1.4 wt)的氨基酸序列如seq idno：1所示。

11、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaatpkksakktpkkakkpaaaagakkakspkkakaakpkkapkspakakavkpkaakpktakpkaakpkkaaakkk(seq id no：1)

12、本发明一实施方式中，所述连接组蛋白h1.4突变体包括seq id no：2-21所示的序列。

13、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaatpkksakktpkkakkpaaaagakkakspkkakaakpkkapkspakakavkpkaakpktakpkaakpkkaaakkkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：2，h1.4+38)

14、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaatpkksakktpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：3，h1.4 157)

15、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaatpkksakktpkkakkpaaaagakisekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：4，h1.4 169)

16、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkgrrgqgqeasrsgeeaqegdggghpqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：5)

17、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpasrsgeeaqegdggghpqeergedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：6)

18、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaaieaqegdggghpqeergedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：7)

19、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakeaqegdggghpqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：8)

20、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpqegdggghpqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：9)

21、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkegdggghpqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：10)

22、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkakggghpqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：11)

23、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkakgvghpqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：12)

24、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatggghpqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：13)

25、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaghpqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：14)

26、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaahpqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：15)

27、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaadpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：16)

28、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaatqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：17)

29、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaatpqeerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：18)

30、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaatpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：19)

31、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaatpkkerqedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：20)

32、msetapaapaapapaektpvkkkarksagaakrkasgppvselitkavaaskersgvslaalkkalaaagydveknnsriklglkslvskgtlvqtkgtgasgsfklnkkaasgeakpkakkagaakakkpagaakkpkkatgaatpkksaiedpkegeeagcscwsqksekpekgessqakkgaqepsegqss(seq id no：21)

33、本发明一实施方式中，所述检测方法包括以下步骤：

34、(1)将分析物制备成测试样品；

35、(2)将所述测试样品添加到生物纳米孔测试体系的cis端；

36、(3)施加电场使待分析物在电渗流或电泳效应作用下迁移，捕获其在纳米孔内产生的电流信号；

37、(4)对迁移过程中产生的电流信号进行分析，识别待分析物的特性；

38、(5)对分析结果进行对比，以实现对至少四种不同分析物的检测与识别。

39、本发明一实施方式中，步骤(1)包括将分析物溶解在测试缓冲液中并混匀。本发明一具体实施方式中，所述测试缓冲液包括中性或弱碱性的测试缓冲液；测试缓冲液的ph不高于8.0。

40、本发明一实施方式中，步骤(2)中所述生物纳米孔测试体系包括生物纳米孔芯片、测试缓冲液。

41、本发明一实施方式中，所述测试缓冲液包括中性或弱碱性的测试缓冲液；测试缓冲液的ph不高于8.0。具体的，所述测试缓冲液包括200mm kcl、150mm铁氰化钾、100mm亚铁氰化钾、25mm pbs，ph＝8.0。

42、本发明一实施方式中，所述生物纳米孔测试体系中测试样品的浓度为10-3000nm。例如10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、2000nm、3000nm。

43、本发明一实施方式中，步骤(3)包括在cis端施加正向电压，使待分析物在电渗流作用下迁移，捕获其在纳米孔内产生的电流信号；在cis端施加负向电压，使待分析物在电泳效应作用下迁移，捕获其在纳米孔内产生的电流信号。

44、本发明一实施方式中，根据待分析物尺寸与纳米孔限制区尺寸的相互作用，或者待分析物尺寸与电场力大小的相互作用，分析其迁移行为并捕获相关电流信号。

45、本发明一具体实施方式中，当分析物的尺寸大于生物纳米孔的限制区尺寸或电场力大小有限时，分析物首先会被生物纳米孔的前庭区捕获，随后在布朗扩散作用下离开生物纳米孔的前庭区并产生特定模式的电流信号；当添加到生物纳米孔cis端的待分析物尺寸合适且施加电场强度达到一定程度时，待分析物会在电场力的作用下通过生物纳米孔的限制区进入到生物纳米孔的trans端，并产生特定模式的电流信号。

46、本发明一实施方式中，所述正向电压的大小为40mv-140mv，优选为90mv。本发明一实施方式中，所述负向电压大小为-140mv-40mv，优选为-90mv。

47、本发明一实施方式中，步骤(4)中所述分析的参数包括阻塞电流的波动范围amp.s.d、事件发生间隔时间interevent intervals(ton)、阻塞幅度δexclude(δi/i0*100％)与阻塞电流的停留时间dwell time。

48、本发明一实施方式中，步骤(5)包括对比电泳效应下的阻塞电流的波动范围以及电渗流效应下阻塞电流的停留时间两个参数，通过对amp.s.d以及dwell time设定不同的阈值达，识别不同的h1.4组蛋白突变体。

49、本发明一实施方式中，在电压为-90mv，电泳效应下样品之间阻塞电流的波动范围的差值为0.2-4.0pa，优选地为0.3-3.3pa；在电压为90mv，电渗流效应下样品之间阻塞电流的停留时间的差值范围为20-300ms，优选地为29.4-245.3ms。

50、本发明第二方面，提供一种用于实现上述检测方法的生物纳米孔分析装置，所述装置包括：

51、(a)生物纳米孔芯片，包括膜和插入膜的单个纳米孔蛋白；

52、(b)电场施加装置，用于在纳米孔上施加特定电场，所述电场施加装置具有电压切换元件，从而在纳米孔施加不同方向电压，实现对分析物电渗流作用和电泳作用的双模式检测；

53、(c)电流信号检测装置，用于检测生物纳米孔内分析物通过时引发的电流信号；

54、(d)信号分析系统，用于对检测到的电流信号进行模式识别，识别不同分析物的种类和特性。

55、本发明一实施方式中，所述膜隔开第一导电液体介质与第二导电液体介质，所述膜可以是有机膜(例如脂质双层)，或者合成膜(例如由聚合物材料形成的膜)。

56、本发明一实施方式中，所述纳米孔蛋白为mspa同源物或其突变体，优选为m2 mspa纳米孔。

57、本发明一实施方式中，所述电流信号为待测蛋白质被纳米孔蛋白捕获后又逃离时，通过纳米孔蛋白的离子产生的信号。

58、本发明一实施方式中，所述信号的参数包括阻塞电流的波动范围amp.s.d、事件发生间隔时间interevent intervals(ton)、阻塞幅度δexclude(δi/i0*100％)与阻塞电流的停留时间dwell time；优选地，所述参数为电泳效应下的阻塞电流的波动范围以及电渗流效应下阻塞电流的停留时间。

59、本发明一实施方式中，所述信号分析系统分析电渗流引发的电流信号模式的至少一个参数和电泳效应引发的电流信号模式的至少一个参数；进一步优选地，分析电泳效应下的阻塞电流的波动范围amp.s.d以及电渗流效应下阻塞电流的停留时间dwell time两个参数。

60、本发明第三方面，提供上述检测方法或分析装置在检测和识别不同蛋白质及其突变体中的应用。

61、优选地，所述检测方法或分析装置可区分蛋白质及其一个或多个突变体，其中至少一个突变体为移码突变体；进一步优选地，待分析物为h1.4蛋白及其移码突变体。

62、相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

63、本发明分别利用mspa的电泳效应以及电渗流效应进行测试，通过综合利用电泳效应下的阻塞电流的波动范围以及电渗流效应下阻塞电流的停留时间两个参数，最终可通过对amp.s.d以及dwell time设定不同的阈值达，便可以更高的精度识别不同的h1.4组蛋白移码突变体。