IL1RAP作为靶点在制备预防和/或治疗乳腺癌肝转移药物中的应用

本发明涉及生物医药领域，具体地说，是白细胞介素-1受体辅助蛋白（il1rap）作为靶点在制备预防和/或治疗乳腺癌肝转移药物中的应用。

背景技术：

1、乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，对全球女性健康构成严重威胁。尽管早期诊断和系统治疗的进步显著改善了早期乳腺癌患者的生存率，但大约20%-30%的乳腺癌患者在原发性肿瘤诊断和治疗后会发生远处转移，约90%的癌症相关死亡归因于转移事件。晚期乳腺癌的发病率每年以4%-6%的速度递增，转移仍然是乳腺癌相关死亡的主要原因。

2、肝脏是常见的乳腺癌远处转移部位。临床数据显示，乳腺癌肝转移的发生率约为40%-50%，而在晚期乳腺癌尸检报告中这一比例更高达55%-75%。约25%的转移性乳腺癌患者以肝脏作为首发或主要转移部位。一旦发生肝转移，通常预示着疾病已进入晚期阶段，患者预后极差。经治疗的中位总生存期仅2-3年，未经治疗者生存期不足1年。

3、乳腺癌是一种异质性疾病，根据激素受体（hr，包括雌激素受体er和孕激素受体pr）和人表皮生长因子受体2（her2）的表达状态，可进一步分为luminal型、her2阳性和三阴性乳腺癌。不同分子分型的乳腺癌表现出明显的器官转移倾向性。luminal型乳腺癌更倾向于骨转移，her2阳性型易发生肝转移和肺转移，而三阴性乳腺癌则常转移至脑、肺和肝。北京大学肿瘤医院对542例乳腺癌肝转移患者的回顾性分析显示，基于肝转移灶的受体状态分型，hr+/her2-型占59.2%，her2+型占24.2%，三阴性型占16.6%。三组的中位总生存期分别为58.0、70.0和26.0个月，三阴性乳腺癌肝转移患者的预后最差。值得注意的是，原发性乳腺癌与肝转移灶之间的受体状态存在显著异质性，整体不一致率达23.6%。er、pr和her2表达的不一致率分别为21.0%、38.6%和10.8%，这一现象提示仅依赖原发性肿瘤的分子分型不足以指导肝转移患者的精准治疗，对肝转移灶进行活检以明确其受体状态具有重要的临床意义。

4、目前乳腺癌肝转移的治疗策略主要包括手术切除、局部消融、全身化疗、内分泌治疗、靶向治疗和免疫治疗等。然而，传统上乳腺癌肝转移被视为系统性全身性疾病，其治疗方案主要以原发乳腺癌特征为指导进行全身性治疗。手术切除和局部消融仅限于病灶较小（通常<5cm）、单发或易于切除、且经过系统治疗后病情稳定的极少数经严格筛选的患者，适宜手术的患者比例不足10%。手术前影像学评估常常低估实际肿瘤负荷，导致约20%的病例在开腹后发现无法切除。对于大多数肝转移患者，全身化疗仍是主要治疗手段，但由于肝转移灶独特的“血管共选择”生长模式——利用周围肝实质现有血管系统维持血供而非依赖新生血管生成，导致其呈现低灌注状态，限制了化疗药物和免疫治疗药物的有效递送，现有治疗效果仍不理想。近年来，cdk4/6抑制剂、pi3k/mtor通路抑制剂等新型靶向药物以及免疫检查点抑制剂的出现为乳腺癌治疗带来了突破，但肝转移患者从这些治疗中的获益仍显著劣于无肝转移患者，亟需开发针对肝转移这一特定器官微环境的新型治疗策略。

5、肝脏作为转移靶器官具有独特的解剖结构和免疫学特性。肝血窦是由肝血窦内皮细胞、肝星状细胞、枯否细胞及肝实质细胞共同构成的高度通透性毛细血管网络，其内皮细胞上分布着穿透性筛孔结构，缺乏完整的基底膜，这使得循环肿瘤细胞能够相对容易地从血液循环中进入肝实质。更重要的是，肝脏是一种兼具免疫防御与免疫耐受双重功能的器官。生理状态下，肝脏通过枯否细胞、肝血窦内皮细胞和肝星状细胞等多细胞网络维持对肠道来源食物抗原及共生微生物产物的免疫耐受。然而，在肿瘤转移过程中，这种免疫耐受微环境可能被肿瘤细胞“劫持”，形成有利于转移定植的“免疫豁免”区域。

6、肝脏微环境中巨噬细胞是数量最丰富的免疫细胞群体，主要包括胚胎起源的枯否细胞（kupffer cells）和骨髓来源的单核细胞衍生巨噬细胞。枯否细胞定居于肝血窦腔内，作为机体抵御循环肿瘤细胞的第一道防线，可捕获并清除进入肝脏的肿瘤细胞。研究显示，在乳腺癌肝转移病灶中，与脑和肺等其他常见转移部位相比，肝转移灶免疫抑制性更强的微环境格局，以活化的调节性t细胞和单核细胞来源巨噬细胞富集为主要特征，而cd8+毒性t细胞的浸润和活化水平相对较低。乳腺肿瘤细胞可通过分泌多种细胞因子和外泌体远程调控肝脏微环境，诱导枯否细胞表型转变，同时大量招募单核细胞来源的巨噬细胞，使其极化为m2型促瘤表型。m2型肿瘤相关巨噬细胞通过分泌il-10、tgf-β等抑制性细胞因子，表达pd-l1、vista等免疫检查点分子，与t细胞竞争关键氨基酸，以及诱导调节性t细胞分化等多种机制，协同抑制cd8+ t细胞功能，形成免疫抑制微环境。因此，肿瘤相关巨噬细胞被认为是乳腺癌肝转移免疫抑制微环境的关键塑造者和潜在治疗靶点。

7、蛋白精氨酸甲基转移酶等分子在调控巨噬细胞功能中发挥重要作用，但关于il-1受体家族成员尤其是其共受体在乳腺癌肝转移中对巨噬细胞功能的调控，目前研究尚不充分。白细胞介素-1受体辅助蛋白（il1rap）是il-1受体家族的关键共受体分子。经典的il-1信号通路中，il-1α或il-1β首先与il-1r1结合形成复合物后招募il1rap，形成异源三聚体复合物，进而招募髓样分化因子88和白介素-1受体激活激酶，激活下游nf-κb和mapk信号通路，启动炎症反应和免疫调节。il-1家族细胞因子（il-1α/β、il-33、il-36α/β/γ）与其主要受体和il1rap结合的一般模式如下：细胞因子结合其主要受体，诱导il1rap的募集，受体胞内结构域和il1rap的细胞内tir结构域形成二聚体，这是招募和结合myd88等下游信号分子的必要条件。il1rap参与il-1家族的三种信号通路：il-1r、il-33r和il-36r，这些途径均显示出促肿瘤活性。

8、近年来，il1rap作为肿瘤治疗靶点逐渐受到关注。研究发现，il1rap在几种癌症中上调，包括血液肿瘤（如急性髓系白血病、慢性髓系白血病）以及实体肿瘤（胰腺癌、结直肠癌和宫颈癌等）。在胰腺癌中，il1rap在大多数患者的肿瘤样本中表达，且其过表达与更差的总生存期相关，敲低il1rap可显著降低胰腺癌细胞系的细胞活力、侵袭性和克隆形成能力。在急性髓系白血病中，il1rap通过激活il-1信号通路促进白血病干细胞存活和自我更新，被认为是白血病干细胞的潜在标志物。在乳腺癌中，尚无研究探讨il1rap在乳腺癌肝转移这一特定器官微环境中的作用，也不清楚肿瘤细胞自身的il1rap是否参与调控肝转移进程和免疫微环境重塑。

9、综上所述，现有治疗手段对乳腺癌肝转移患者的临床疗效有限，亟需发掘新的治疗靶点和干预策略。尽管已有研究揭示了il-1受体家族在肿瘤细胞增殖和免疫逃逸等一般性机制中的功能，但对于该家族在器官特异性转移中的调控作用仍缺乏系统深入的研究。特别是il1rap在乳腺癌肝转移中的作用、其对肝脏免疫微环境的调控机制以及靶向il1rap的治疗价值，目前尚无研究报道。因此，阐明il1rap在乳腺癌肝转移中的功能及其分子机制，对于开发新的治疗策略具有重要的理论意义和临床价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种预防和/或治疗乳腺癌肝转移的新靶点——il1rap，及其在制备相关药物中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、1、il1rap在乳腺癌肝转移中高表达且与不良预后相关：通过kaplan-meierplotter数据库分析，il1rap高表达在总体乳腺癌队列及各分子亚型中均与更差的总生存期显著相关。

4、2、敲低il1rap显著抑制乳腺癌肝转移：在小鼠脾脏注射肝转移模型中，敲低il1rap显著减少肝表面转移结节数量，减轻肝脏重量，而对原位肿瘤生长无影响，提示il1rap特异性调控肝转移进程。

5、3、il1rap通过nf-κb/ccl4轴调控巨噬细胞招募和极化：机制研究表明，肿瘤细胞中的il1rap通过激活nf-κb信号通路上调ccl4表达，ccl4分泌后作用于巨噬细胞表面的ccr5受体，促进肿瘤相关巨噬细胞的招募和m2型极化，mgp、tmem176a分子的表达，形成免疫抑制微环境，从而促进肝转移。使用nf-κb抑制剂或ccr5拮抗剂均可阻断此效应。

6、4、靶向il1rap下游信号增强免疫治疗疗效：在肝转移小鼠模型中，il1rap敲低联合pd-1单抗治疗显著增强抗肝转移效果，优于单一治疗。

7、基于上述技术方案，本发明的第一方面，提供il1rap蛋白或其编码序列作为药物靶点在制备预防和/或治疗乳腺癌肝转移药物中的应用。

8、进一步地，所述的预防和/或治疗乳腺癌肝转移的药物以il1rap作为干预靶点，通过抑制il1rap的表达或功能来实现。

9、本发明的第二方面，提供抑制il1rap表达和/或功能的试剂在制备预防和/或治疗乳腺癌肝转移的药物中的应用。

10、进一步地，所述的抑制il1rap表达和/或功能的试剂包括但不限于：

11、特异性结合il1rap的抗体或其抗原结合片段；

12、特异性干扰il1rap基因表达的小干扰rna（sirna）、短发夹rna（shrna）、反义寡核苷酸，或包含上述干扰分子的重组载体或重组病毒；

13、靶向il1rap的crispr-cas9基因编辑系统；

14、il1rap拮抗剂、下调剂、阻断剂。

15、更进一步地，所述的抑制il1rap表达和/或功能的试剂为特异性干扰il1rap基因表达的短发夹rna（shrna）；所述的shrna的核苷酸序列选自seq id no.1- seq id no.5中的任一或两种以上。

16、进一步地，所述的抑制il1rap表达和/或功能的试剂为包含特异性干扰il1rap基因表达的shrna的慢病毒载体。

17、更进一步地，所述的抑制il1rap表达和/或功能的试剂为包含如上所述shrna的plko.1慢病毒载体。为了提高敲低效率，可以采用数条敲低序列慢病毒混合感染细胞，构建稳定敲低细胞。

18、本发明的第三方面，提供抑制il1rap表达和/或功能的试剂与pd-1单抗联用在制备预防和/或治疗乳腺癌肝转移的药物中的应用。

19、本发明的第四方面，提供一种预防和/或治疗乳腺癌肝转移的药物组合物，所述的药物组合物包含抑制il1rap表达和/或功能的试剂，以及药学上可接受的载体或辅料。

20、进一步地，所述的药物组合物还包括pd-1单抗。

21、本发明优点在于：

22、1、本发明首次揭示il1rap在乳腺癌肝转移中的关键促进作用，填补了该技术领域的空白。现有研究仅关注il-1受体家族在免疫细胞中的功能或肿瘤细胞的一般性增殖转移机制，而本发明通过体内全家族功能筛选，首次系统鉴定出肿瘤细胞自身的il1rap是特异性调控肝转移的核心分子，敲低il1rap可显著抑制肝转移灶形成（抑制率约70%）而不影响原位肿瘤生长，展现出良好的器官选择性，有望降低全身毒副作用。在机制层面，本发明首次阐明了il1rap/nf-κb/ccl4/ccr5信号轴调控肝转移免疫微环境的完整通路：肿瘤细胞il1rap通过激活nf-κb上调ccl4分泌，ccl4与巨噬细胞ccr5受体结合，促进肿瘤相关巨噬细胞招募及m2型极化，形成免疫抑制微环境。

23、2、本发明进一步通过单细胞测序技术，对肝转移组织中的免疫细胞进行高分辨率解析，首次鉴定出三个在il1rap敲低后显著减少的巨噬细胞亚群。这三个亚群均高表达m2型巨噬细胞相关基因（如arg1、mrc1、cd163、il10），且共同高表达三个特征性分子：mgp（matrix gla protein）、tmem176a和tmem176b。体外共培养实验进一步证实，敲低肿瘤细胞il1rap可显著抑制共培养巨噬细胞中mgp、tmem176a及m2型标志物的表达；同时，巨噬细胞的迁移能力亦显著减弱。小鼠肝转移样本的多色免疫荧光发现：mgp+ tmem176a+的巨噬细胞浸润也在敲低il1rap组显著减少了。上述发现不仅揭示了il1rap调控肝转移免疫微环境中特定促瘤巨噬细胞亚群的分子基础，也为靶向mgp或tmem176a/b阳性巨噬细胞提供了新的潜在干预节点。

24、3、本发明为靶向干预提供了明确的分子节点。il1rap的敲低能够显著抑制小鼠乳腺癌肝转移灶的形成，且与pd-1单抗联合应用产生显著协同抗肿瘤效应，同时显著降低了肝转移组织中mgp+ tmem176a+巨噬细胞的浸润，有效解决了肝转移患者对免疫治疗响应不佳的临床难题。本发明提供的靶点和联合治疗策略覆盖基因治疗和抗体药物等多种形式，由于il1rap在肝转移中特异性发挥作用，靶向该分子有望减少对正常组织的副作用，具有临床转化周期短、安全性明确、适应症拓展潜力大等突出优点，具备极高的科学价值、临床开发前景和市场前景。