一种复合水凝胶及其制备方法和应用

本发明涉及水凝胶，尤其是指一种复合水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、骨缺损是临床实践中面临的严峻挑战，通常由严重创伤、骨肿瘤切除及感染性疾病引起，常导致患者功能障碍和生活质量显著下降。尽管自体骨移植和异体骨移植仍是目前临床治疗骨缺损的金标准术式，但供区并发症、来源受限以及潜在的免疫排斥反应等问题极大地制约了其广泛应用。在此背景下，骨组织工程策略为骨缺损的再生修复提供了新的思路和解决方案。理想的人工骨修复支架应具备以下关键特征：（1）优异的生物相容性，以支持细胞黏附、增殖和分化；（2）与新生骨组织形成速率相匹配的生物降解性；（3）适配骨缺损区域的力学性能；（4）良好的骨传导性和骨诱导性，能够主动引导并促进新骨形成。

2、在骨再生过程中，细胞外基质（extracellular matrix，ecm）发挥着不可替代的作用，它不仅是细胞生长的物理支架，更通过复杂的信号网络调控细胞命运，介导新生组织与原始组织之间的物质交换和信息传递。近年来，水凝胶因其高含水量、三维多孔网络结构以及与天然ecm高度相似的物理化学特性，在生物医学领域引起了广泛关注，被公认为构建骨组织工程支架的理想候选材料。其中，gelma是一种经化学改性的明胶衍生物，保留了明胶分子中天然的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（rgd）序列和基质金属蛋白酶（mmp）降解位点，具有优异的光交联特性和可调的力学性能，已在骨再生研究中展现出巨大潜力。透明质酸（ha）是天然ecm的重要组成成分，广泛分布于骨组织等结缔组织中，具有良好的生物相容性和生物降解性。经醛基化修饰后，ha-cho可通过其醛基与明胶分子的游离氨基发生席夫碱反应，形成动态共价交联网络。这种动态交联策略不仅避免了传统化学交联剂可能带来的细胞毒性，还能赋予水凝胶自愈合和可注射等特性。因此，将gelma的光交联网络与gelma/ha-cho的动态席夫碱网络相结合，有望构建兼具优异力学性能和仿生微环境的多重交联复合水凝胶体系。

3、然而，单纯的水凝胶基质往往缺乏足够的生物活性，难以高效诱导骨缺损的再生修复。因此，向水凝胶体系中引入合适的活性成分以增强其成骨活性显得尤为重要。转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta 1，tgf-β1）是一种具有多种生物学功能的生长因子，在骨代谢和骨再生过程中发挥核心调控作用。研究表明，tgf-β1可促进间充质干细胞向成骨细胞方向分化和趋化迁移，并能上调碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素等成骨相关标志物的表达。然而，tgf-β1等蛋白类生长因子在体内环境中半衰期较短，易被酶解而快速失活，传统的直接给药方式难以在缺损部位维持有效的治疗浓度，反复注射则增加了感染风险和患者痛苦。因此，开发能够缓释tgf-β1并长期维持其生物活性的递送载体，是实现高效、安全骨再生的关键环节。

4、碳点（carbon dots，cds）作为一类新兴的零维碳基纳米材料，因其优异的荧光性能、良好的水溶性、低细胞毒性和灵活的制备方法而备受关注。近年来，越来越多的研究发现，通过选择含特定功能基团的前驱体，可以赋予碳点独特的生物活性。l-精氨酸（l-arginine，l-arg）是一种参与蛋白质合成、血管生成和免疫调节等多种生物过程的功能性氨基酸。研究表明，l-精氨酸作为一氧化氮（no）的内源性前体物质，其代谢产生的no在骨代谢调节中扮演重要角色，能够通过no信号通路促进成骨细胞的增殖与分化，并在骨发育过程中发挥关键调控作用。以l-精氨酸为前驱体制备的arg-cds，不仅继承了碳点纳米材料的诸多优点，还有望保留l-精氨酸的血管生成活性和生物调节功能，作为兼具纳米递送载体和生物活性组分双重角色的新型材料，在骨缺损修复中具有独特的应用前景。基于上述背景，本发明提供一种复合水凝胶的制备方法及其制备方法和应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种复合水凝胶的制备方法及其制备方法和应用，其本发明以l-精氨酸为原料通过热解法制备arg-cds，以透明质酸为原料通过高碘酸钠氧化制备ha-cho，再以gelma和ha-cho为基质，通过光交联与席夫碱反应构建双网络水凝胶，制备方法操作简便、反应条件温和，可实现arg-cds和tgf-β1的高效负载与可控释放，具有良好的工艺可重复性和规模化生产潜力；本发明复合水凝胶可作为骨缺损修复的候选支架材料，尤其适用于临界尺寸颅骨缺损的修复，具有良好的临床应用前景和转化潜力。

2、为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：

3、一种复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

4、s1、arg-cds的制备：以l-精氨酸为原料，采用热解法制备arg-cds；

5、s2、ha-cho的制备：以透明质酸为原料，经高碘酸钠氧化、终止反应、透析和冷冻干燥，得到ha-cho；

6、s3、arg-cds/gelma/ha-cho复合水凝胶的制备：s31、前驱体溶液配制；s32、纳米复合体系混合；s33、光交联成胶；s34、动态共价交联。

7、作为一种优选方案：所述步骤s1具体为：对精氨酸粉末进行热处理，冷却后，将残渣溶解于超纯水中，所得浑浊液经超声处理，离心，透析；将透析后的溶液冷冻并真空干燥，得到粉末状arg-cds。

8、作为一种优选方案：所述步骤s1中热处理条件为：煅烧温度240℃，升温速率4℃/min，热解时间3 h；离心条件为：在室温下以15,000 r/min离心30 min；得到粉末状arg-cds于4℃条件下冷藏保存。

9、作为一种优选方案：所述步骤s2具体为：取ha加入去离子水中溶解，向溶液中加入高碘酸钠，搅拌反应2-3h；反应结束后，加入乙二醇终止反应；透析完成后，将溶液冷冻干燥得到ha-cho。

10、作为一种优选方案：所述步骤s31、前驱体溶液配制具体为：将甲基丙烯酰化明胶，即gema，以及醛基化透明质酸，即ha-cho，加入含光引发剂lap的磷酸盐缓冲液，所述光引发剂lap为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，其浓度为1 mg/ml，分别制得10%（w/v）gema溶液和5%（w/v）ha-cho溶液；所述步骤s32、纳米复合体系混合具体为：取上述gema溶液与ha-cho溶液按体积比1:1混合，最终gema浓度为5%，ha-cho为2.5%，并加入1 mg/ml的arg-cds储备液；混合后均匀分散。

11、作为一种优选方案：所述步骤s33、光交联成胶具体为：将步骤s32中的混合溶液于紫外光下照射；光引发剂lap在紫外光下裂解产生自由基，引发gema侧链甲基丙烯酸酯基团之间的自由基链式聚合，形成第一重共价交联网络。

12、作为一种优选方案：所述步骤s34、动态共价交联具体为：在步骤s33光交联光的同时或之后，ha-cho上的醛基与gema分子链上残余的游离氨基发生席夫碱反应，生成可逆的亚胺键，构建第二重动态共价交联网络，最终得到双网络复合水凝胶。

13、一种复合水凝胶，采用所述制备方法制备得到。

14、一种所述制备方法制备得到的复合水凝胶的应用，所述复合水凝胶用于制备修复骨缺损的支架。

15、作为一种优选方案：所述骨缺损为颅骨缺损；所述复合水凝胶用于促进骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和成骨分化。

16、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知，本发明以l-精氨酸为原料通过热解法制备arg-cds，以透明质酸为原料通过高碘酸钠氧化制备ha-cho，再以gelma和ha-cho为基质，通过光交联与席夫碱反应构建双网络水凝胶，制备方法操作简便、反应条件温和，可实现arg-cds和tgf-β1的高效负载与可控释放，具有良好的工艺可重复性和规模化生产潜力；本发明复合水凝胶可作为骨缺损修复的候选支架材料，尤其适用于临界尺寸颅骨缺损的修复，具有良好的临床应用前景和转化潜力。

17、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。