基于纳米孔测序的质粒序列从头组装方法与流程

本发明涉及基因组组装机生物信息学，具体为基于纳米孔测序的质粒序列从头组装方法。

背景技术：

1、质粒（plasmid）是细菌等微生物中独立于染色体的环状dna分子，在合成生物学、基因工程、菌株鉴定与分子生物学实验中，常常需要获得其完整、准确、闭合（环状）的全长序列。纳米孔测序 （oxford nanopore technology）的单条读长可贯穿整个质粒，理论上适合质粒的全长从头组装； 但其原始读段错误率较高，且存在嵌合读段（chimeric reads）、读长分布不均等问题，给从头组装 带来显著困难。

2、目前纳米孔质粒组装通常采用“单一测序深度+单一组装器+抛光纠错”的流水线，存在如下缺陷：

3、（一）组装结果对输入测序深度高度敏感：同一组装软件在不同覆盖度下往往给出不同的组装长度、不同的环化判断与不同的片段数，深度过低则信息不足、深度过高则噪声与嵌合读段累积，且不存在一个对所有样本均最优的固定深度；

4、（二）单一组装算法存在系统性偏差：基于重复图(repeat graph)/重叠布局（olc）的组装软件（如 flye）擅长解析重复，但对小质粒可能错误环化或 将单体错误地组装为双体/多体级联（concatemer），而基于重叠布局且不纠错的组装软件（如 miniasm）速度快但倾向产生偏短、片段化的结果，单独依赖任一种，其特有的系统性错误均无法被发现和纠正；

5、（三）在无参考序列的前提下，缺乏可靠的正确结果判定准则，传统做法依赖人工经验挑选，难以规模化且可重复性差。

6、现有相关工具亦未解决上述问题：flye、miniasm/minimap2 等为单组装器；medaka、 homopolish 等仅进行共识抛光与同源纠错，并不解决在众多候选中选择哪一个组装的问题， 若输入组装本身错误，抛光只会得到精修过的错误序列；circuitseq 等质粒流程本质仍是固定 参数下的单路组装；与本发明最接近的 trycycler 通过对多个组装结果进行聚类、调和来提高长读组装质量，但其需要大量人工交互判断（人工确认聚类、人工选择代表序列），不进行系统的测序深度梯度抽样，也不以叠连群（contig）长度的聚类共识、结合多个组装器对contig的支持数与覆盖均匀度做全自动选优。

7、因此，有必要针对现有技术的缺陷，提出一种无参考、全自动的质粒序列从头组装方法。

技术实现思路

1、本发明提出一种基于纳米孔测序的质粒序列从头组装方法，以至少解决现有技术中存在的诸多问题之一。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种基于纳米孔测序的质粒序列从头组装方法，其步骤包括：

4、s1.对纳米孔原始测序读段进行预处理获得高质量的读段集合；

5、s2.基于读段集合估算组装质粒大小和平均测序深度；

6、s3.依据平均测序深度与读段总量，设置多档目标覆盖度，对读段集合分别抽样，得到具有不同测序深度的读段子样本集；

7、s4.对每一个测序深度子样本分别用多种正交算法从头组装，得到候选组装集合；

8、s5. 对候选组装集合进行筛选并聚类得到最优组装，包括：

9、对候选组装集合执行预筛选，保留环状且数量低于阈值的候选叠连群进入候选池；

10、对候选池内叠连群长度执行粗聚类得到多个簇，筛选成员数达阈值且不全来自碎片化组装的簇得到合格簇；

11、基于组装算法支持种类数、成员数、覆盖均匀度从合格簇中确定最优簇；

12、对最优簇执行长度细聚类，根据成员数筛选得到合格子簇；

13、再基于组装算法支持种类、成员数量、覆盖均匀度指标确定最优子簇；

14、选取最优子簇内覆盖均匀度最优的叠连群作为样本最优组装；

15、s6.对最优组装进行抛光与定型得到闭合的质粒序列。

16、进一步地，步骤s1中，所述预处理包括剔除人工引入的非目标序列、去除嵌合干扰、过滤低质量及无效短片段中的至少一种。

17、进一步地，步骤s2中，先以读段集合按质粒模式从头组装得到初始组装的叠连群，根据所述叠连群估算所述质粒大小和平均测序深度。

18、进一步地，步骤s3中，所述多档目标覆盖度包含30-500×之间的测序深度；

19、和/或，所述多档目标覆盖度为18档；

20、和/或，步骤s4从头组装算法包括 flye 与 miniasm。

21、进一步地，步骤s5中，所述合格簇筛选条件为：簇成员数达到预设阈值，候选池总候选数大于10时阈值取3，候选池总候选数不大于10时阈值取2，且簇内至少存在一条成员来自仅含1条叠连群的组装结果。

22、优选的，步骤s5中，所述最优簇的筛选方式为，优先选取被不同组装算法支持种类最多的簇；支持种类相同时选取成员数量最大的簇；若存在其他合格簇的平均覆盖均匀度指标为该成员数量最大簇平均覆盖均匀度指标的0.5倍及以下，则选取该其他合格簇作为最优簇。

23、优选的，步骤s5中，所述合格子簇筛选条件为：子簇成员数达到预设阈值，最优簇总成员数大于3时阈值取2，最优簇总成员数不大于3时阈值取 1；确定最优子簇规则为：优先选取成员数量最大的子簇，若存在其他子簇的平均覆盖均匀度指标为该成员数量最大子簇平均覆盖均匀度指标的 0.5 倍及以下，则选取该其他子簇作为最优子簇；选取最优子簇中覆盖变异系数 cv 最小的叠连群作为样本最优组装。

24、进一步地，所述覆盖均匀度指标为覆盖变异系数，取值为滑动窗口测序深度的标准差与窗口测序深度均值的比值。

25、进一步地，步骤s6中，所述抛光定型为对最优组装依次执行共识抛光、序列起点旋转、再次共识抛光、同源纠错，得到最终闭合的质粒序列。

26、本发明还提出一种基于纳米孔测序的质粒序列从头组装系统，其包括：

27、预处理模块：对纳米孔原始测序读段进行预处理获得高质量的读段集合；

28、估算模块：基于读段集合估算组装质粒大小和平均测序深度；

29、抽样模块：依据平均测序深度与读段总量，设置多档目标覆盖度，对读段集合分别抽样，得到具有不同测序深度的读段子样本集；

30、组装模块：对每一个测序深度子样本分别用多种正交算法从头组装，得到候选组装集合；

31、聚类筛选模块：对候选组装集合进行筛选并聚类得到最优组装，包括：

32、对候选组装集合执行预筛选，保留环状且数量低于阈值的候选叠连群进入候选池；

33、对候选池内叠连群长度执行粗聚类得到多个簇，筛选成员数达阈值且不全来自碎片化组装的簇得到合格簇；

34、基于组装算法支持种类数、成员数、覆盖均匀度从合格簇中确定最优簇；

35、对最优簇执行长度细聚类，根据成员数筛选得到合格子簇；

36、再基于组装算法支持种类、成员数量、覆盖均匀度指标确定最优子簇；

37、选取最优子簇内覆盖均匀度最优的叠连群作为样本最优组装；

38、抛光纠错模块：对最优组装进行抛光与定型得到闭合的质粒序列。

39、相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

40、本发明所述从头组装方法通过测序深度梯度与多组装器双重并用，并以组装结果重复性判别正确的信号，规避了固定深度与单一算法的系统性错误，使得正确组装大概率能产生，并能从包含正确组装与众多错误组装（如错误环化、长度漂移、碎片化等）的结果中能识别出正确组装。

41、本发明所述从头组装方法可自动纠正单一组装器的系统性假象：当某一组装器对部分样本输出双体/多体级联的错误长度时，本方法借助跨组装器支持与长度聚类，自动确定真实的单体长度。

42、通过本发明提供的组装方法可实现结果可重复、精度与稳健兼顾：选优基于客观的聚类与 cv 准则，相同输入得到相同结果；两级聚类先以宽半径排除离群错误、再以窄半径锁定精确共识长度，cv 进一步保证选中的是覆盖均匀的序列。全过程无需参考序列、无需人工挑选，直接输出最优闭合质粒序列，可规模化批量处理。