一种ROS响应型表面功能涂层及其制备与应用的制作方法

本发明涉及生物医用材料，特别是一种ros响应型表面功能涂层及其制备与应用。

背景技术：

1、急性肺损伤（ali）及其重症形式急性呼吸窘迫综合征（ards）是临床常见的危重症，以失控性炎症反应、过量活性氧（ros）蓄积、肺泡屏障破坏及重度肺水肿为核心病理特征，病死率长期居高不下。过量ros不仅直接造成肺组织氧化损伤，还会激活nf-κb等炎症通路，诱发促炎因子大量释放，形成“氧化应激-炎症风暴”的恶性循环，是导致肺损伤快速进展的关键诱因。目前临床仍以机械通气、液体管理等支持性治疗为主，缺乏能够同步阻断氧化应激与炎症级联反应的靶向干预手段。

2、益生菌因安全性高、可局部定植、易于基因工程改造等优势，已成为肺部疾病局部递送与免疫调控的潜在载体。然而，天然益生菌在应用中存在明显缺陷：一是自身不具备ros清除能力，难以在高氧化应激的损伤肺组织中存活与定植；二是菌体在炎性肺组织驻留时间短、靶向富集能力弱；三是单-益生菌难以同时实现抗氧化、抗炎、病灶微环境响应等多重功能，导致其在急性肺损伤中的治疗效果有限，临床转化受阻。

3、为提升益生菌的生存能力与功能化水平，材料表面修饰成为重要改进路径。现有菌体包覆材料多以单纯保护菌体为目的，缺乏对病灶微环境的响应能力，无法实现活性成分的定点释放；部分抗氧化涂层虽可清除自由基，但难以与工程益生菌的免疫调控功能形成协同；同时，多数包覆体系存在制备条件苛刻、生物相容性差、在肺部复杂环境中稳定性不足等问题，难以满足活体生物治疗剂的应用要求。

4、综上，当前亟需开发一种通过合成生物学手段改造的益生菌，使其分泌il-4等抗炎细胞因子，能够实现对肺部炎症的定向调控；并且结合具备ros响应解离、高效清除活性氧、可适配工程益生菌表面修饰的新型功能涂层，以解决益生菌在肺部氧化应激环境中存活差、定植弱、功能单-等瓶颈，实现抗氧化与免疫调控的协同增效，为急性肺损伤等炎症相关性呼吸系统疾病提供新型载体与功能化解决方案。

技术实现思路

1、针对以上缺陷，本发明提供一种ros响应型表面功能涂层及其制备与应用。具体内容如下。

2、一种ros响应型表面功能涂层，所述涂层为双层复合结构，由fe-b无机内层与苯硼酸接枝海藻酸钠外层通过动态硼酸酯键组装而成，整体包覆于益生菌菌体表面；所述fe-b无机内层由fe3+与硼酸盐在益生菌表面原位配位生成并具有ros清除活性；所述苯硼酸接枝海藻酸钠外层借助动态硼酸酯键共价结合于fe-b无机内层表面，可在高ros微环境下发生硼酸酯键断裂，实现涂层响应性解离；所述涂层包覆后不影响益生菌菌体活性及功能表达。

3、上述ros响应型表面功能涂层的制备方法，依次完成工程益生菌构建、苯硼酸接枝海藻酸钠制备、菌体表面原位形成fe-b无机内层、结合苯硼酸接枝海藻酸钠外层四大工序，制得涂层包覆的功能化工程益生菌。

4、上述ros响应型表面功能涂层在制备急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征治疗制剂中的应用。

5、优选技术方案

6、ros响应型表面功能涂层

7、进-步地，所述苯硼酸接枝海藻酸钠由海藻酸钠与3-氨基苯硼酸经edc/nhs催化发生酰胺化反应制得；所述fe-b无机内层由三氯化铁与硼砂在菌体表面原位矿化生成。

8、进-步地，所述益生菌为可分泌il-4的工程副干酪乳杆菌lap_4；所述工程副干酪乳杆菌以副干酪乳杆菌为底盘菌株，通过重组质粒组成型表达并分泌小鼠源il-4抗炎细胞因子。

9、ros响应型表面功能涂层的制备方法

10、一种前述ros响应型表面功能涂层的制备方法，包括如下步骤：

11、s1、制备分泌il-4的工程副干酪乳杆菌lap_4；

12、s2、制备苯硼酸接枝海藻酸钠sa-pba；

13、s3、在工程副干酪乳杆菌lap_4菌体表面原位形成fe-b无机内层；

14、s4、通过动态硼酸酯键结合sa-pba外层，得到ros响应型涂层包覆的工程益生菌。

15、进-步地，步骤s3具体为：将菌体重悬于ph=8.0的tris-hcl缓冲液，依次加入三氯化铁溶液与硼砂溶液，涡旋混匀后在菌体表面原位生成fe-b无机内层。

16、进-步地，步骤s4具体为：向包覆fe-b无机内层的菌液中加入sa-pba溶液，于37℃、500rpm条件下反应0.5h，制得双层涂层包覆菌体。

17、进-步地，所述sa-pba的制备步骤为：向海藻酸钠水溶液中加入edc、nhs与3-氨基苯硼酸，室温搅拌反应，反应完成后经透析、冻干，得到sa-pba固体。

18、进-步地，所述工程副干酪乳杆菌lap_4的构建方法为：将融合分泌信号肽spusp45的小鼠il-4基因插入搭载组成型强启动子p23的pib184质粒，构建重组质粒pib184-sp-il-4；将重组质粒经大肠杆菌扩增后，电转化至副干酪乳杆菌，筛选获得可组成型分泌il-4的工程菌株lap_4。

19、涂层的应用

20、前述ros响应型表面功能涂层在制备急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征治疗制剂中的应用。

21、进-步地，所述治疗制剂能够清除肺部过量ros，抑制tnf-α、il-6、il-1β促炎因子释放，诱导巨噬细胞向m2抗炎表型极化，降低肺湿干重比并修复肺泡结构，同时调控肺部微生态与代谢稳态。

22、进-步地，所述治疗制剂适用于lps诱导或铜绿假单胞菌诱导的急性肺损伤模型，兼具抗氧化、抗炎、免疫调控、抗菌、微生态重塑的协同作用。

23、如图1所示，通过il-4介导m1向m2巨噬细胞极化，清除ros、抑制il-6或tnf-α释放，减轻气道上皮氧化损伤与局部炎症，最终缓解肺部水肿、全身炎症性脾肿大，实现肺部抗炎修复；

24、如图2所示，先基因编辑构建能分泌il-4的副干酪乳杆菌lap_4，再通过苯硼酸-fe3+配位，在菌体表面组装ros敏感型海藻酸钠复合涂层，制备得到靶向肺部炎症微环境、可释放il-4的功能工程菌制剂m@lap_4，对应图1的抗炎修复机制。

25、（一）本发明提供的ros响应型表面功能涂层具有优异的微环境响应特异性，能够在高活性氧病理微环境下快速解离，实现包覆菌体的病灶靶向释放，避免在正常组织中提前释药，显著提升作用位点特异性与生物利用度。

26、（二）所述涂层兼具高效ros清除能力，可直接降解肺损伤部位过量活性氧，打断“氧化应激-炎症级联放大”的病理恶性循环，从源头减轻肺组织氧化损伤，解决传统益生菌不具备自主抗氧化能力的技术缺陷。

27、（三）该涂层通过温和仿生矿化与动态化学键组装实现，制备条件温和、生物相容性高，不影响益生菌活性与il-4分泌功能，同时显著提升工程益生菌在肺部炎性环境中的存活率、定植率与驻留时间，突破传统益生菌肺部递送易被清除的瓶颈。

28、（四）本发明涂层可与工程益生菌形成协同增效作用，实现抗氧化加抗炎免疫调控的双重功能整合，能够显著抑制tnf-α、il-6等促炎因子释放、诱导巨噬细胞向抗炎表型极化，同时降低肺湿干重比、改善肺组织病理损伤，效果显著优于单-益生菌或单-抗氧化材料。

29、（五）所述涂层具有良好的结构通用性与扩展性，可适用于多种益生菌及活体生物治疗剂的表面修饰，无需复杂改造即可赋予菌体ros响应、抗氧化、靶向富集等功能，为炎症相关呼吸系统疾病提供模块化、可复制的功能化平台。

30、（六）本发明涂层可重塑肺部微生态稳态与代谢平衡，显著提升有益菌丰度并上调保护性代谢物水平，弥补传统治疗手段忽视微生态调控的不足，具备长效、稳定、多靶点的综合优势，更适合临床转化应用。