一种代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂的制备方法和应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂的制备方法和应用。

背景技术：

1、随着细菌感染对抗生素的耐药性越来越强，需要下一代疗法来对抗潜在大流行病的传播。具有抗原隐藏和离子捕获的细菌生物膜通常会导致免疫稳态失衡和难治性慢性感染。

2、在此，干酪乳杆菌在含铜锌基分子筛咪唑酸盐框架内被生物拟矿化。全包覆矿化益生菌生物试剂的成功设计和应用为治疗种植体相关感染提供了新的策略。但是目前仍存在诸多问题，如：

3、1、细菌灭活方式不温和：乙醇直接灭活易破坏细菌表面膜蛋白、寡糖等关键结构，影响后续功能发挥；

4、2、菌株安全性不足：所用细菌未通过fda认证，临床应用风险较高；

5、3、矿化效果差：混合吸附法导致矿化覆盖率极低，无法实现全包覆，难以精准调控细菌代谢与功能释放；

6、4、治疗效能局限：cdt缺乏充足h2o2底物，ros生成不足，无法有效破坏致密生物膜（eps）屏障；

7、5、未解决免疫抑制问题：忽视生物膜微环境中乳酸介导的免疫抑制，无法激活宿主先天免疫与适应性免疫，难以清除残留细菌，易复发；

8、6、治疗模式单一：仅依赖单一抗菌机制，未形成协同效应，对抗多重耐药菌效果不佳。

技术实现思路

1、（一）解决的技术问题

2、鉴于此，本发明的主要目的之一在于提供一种代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂的制备方法和应用。本发明提供的代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂通过结合生物（干酪乳杆菌与乳酸氧化酶）、物理（矿化包覆）、化学（活性氧）和激活人体免疫（巨噬细胞、树突状细胞、t细胞）的多模式协同治疗策略，可作为一种很有前景的抗菌制剂。

3、（二）技术方案

4、为了实现上述目的，本发明提供了一种代谢响应型全包覆矿化益生菌试剂（

l.

casei@（lox-cuzn-zif），简称llcm），包括金属有机骨架、乳酸氧化酶（lox）和干酪乳杆菌（

lacticaseibacillus casei，cicc 6117，

l. casei）。

5、在一个实施例中，所述金属有机骨架包括金属离子和咪唑酸盐配体。

6、在一个实施例中，所述金属离子包括锌离子和/或铜离子。

7、在一个实施例中，所述金属离子包括锌离子和铜离子。

8、在一个实施例中，所述咪唑酸盐配体包括咪唑、2-甲基咪唑、苯并咪唑、2-乙基咪唑、1-甲基咪唑、2-氨基咪唑、5-甲基苯并咪唑、2-苯基咪唑、4-甲基咪唑和/或1-乙烯基咪唑。

9、在一个实施例中，所述咪唑酸盐配体是2-甲基咪唑。

10、在一个实施例中，所述2-甲基咪唑与乳酸氧化酶的质量比为（900~1100）：1。

11、在一个实施例中，所述2-甲基咪唑与乳酸氧化酶的质量比为（950~1050）：1。

12、在一个实施例中，所述2-甲基咪唑与乳酸氧化酶的质量比为1000：1。

13、在一个实施例中，所述乳酸氧化酶与干酪乳杆菌的质量比为（1~10）：1。

14、本发明在另一方面提供了所述代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂的制备方法，包括：

15、s1：将咪唑酸盐配体与乳酸氧化酶溶于溶剂中制备混合物a；

16、s2：将金属离子溶液与干酪乳杆菌混合得到反应中间液；

17、s3：将混合物a加入反应中间液混合后反应得到所述代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂。

18、在一个实施例中，所述咪唑酸盐配体包括咪唑、2-甲基咪唑、苯并咪唑、2-乙基咪唑、1-甲基咪唑、2-氨基咪唑、5-甲基苯并咪唑、2-苯基咪唑、4-甲基咪唑和/或1-乙烯基咪唑。

19、在一个实施例中，所述咪唑酸盐配体是2-甲基咪唑。

20、在一个实施例中，所述2-甲基咪唑与乳酸氧化酶的质量比为（900~1100）：1。

21、在一个实施例中，所述2-甲基咪唑与乳酸氧化酶的质量比为1000：1。

22、在一个实施例中，所述2-甲基咪唑与乳酸氧化酶的用量分别为1.538g和1.538mg。

23、在一个实施例中，所述溶剂为水。

24、在一个实施例中，所述水的用量为8~12ml。

25、在一个实施例中，所述水的用量为10ml。

26、在一个实施例中，所述金属离子包括锌离子和/或铜离子。

27、在一个实施例中，所述金属离子包括锌离子和铜离子。

28、在一个实施例中，所述金属离子的配置方法包括：将二水醋酸锌和二醋酸铜水合物共溶解于去离子水中。

29、在一个实施例中，所述二水醋酸锌和二醋酸铜水合物的摩尔比为（1~5）：1。

30、在一个实施例中，所述二水醋酸锌和二醋酸铜水合物的摩尔比为2：1。

31、在一个实施例中，所述二水醋酸锌和二醋酸铜水合物的用量分别20mm和10mm。

32、在一个实施例中，所述去离子水的用量为10ml。

33、在一个实施例中，所述s2中混合方法为将所述金属离子溶液加入到干酪乳杆菌中并搅拌。

34、在一个实施例中，所述加入速度为3~5min。

35、在一个实施例中，所述2-甲基咪唑与干酪乳杆菌的质量比为1538：0.25。

36、在一个实施例中，所述干酪乳杆菌的用量为0.25mg。

37、本发明在另一方面还提供了一种代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂，所述代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂由上述制备方法得到。

38、本发明在另一方面还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：

39、（1）治疗有效量的上述代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂；

40、（2）药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。

41、本发明在另一方面还提供了一种药物制剂，包括上述的药物组合物。

42、本发明在另一方面还提供了一种药物产品，包括上述的药物制剂。

43、在一个实施例中，所述药物产品包括药瓶或药盒。

44、本发明在另一方面还提供了上述代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂、药物组合物、药物制剂和/或药物产品在制备治疗细菌感染药物中的应用。

45、核心作用机制为（如图10所示）：

46、1、响应激活：llcm进入酸性bme（ph6.5）后，cuzn-zif框架加速降解，释放

l. casei与lox；

47、2、乳酸生成：

l. casei恢复代谢活性，在酸性生物膜微环境中大量产乳酸（适配bme最佳产酸条件）；

48、3、级联cdt：lox催化乳酸生成h2o2，h2o2在cu²+作用下发生类fenton反应，生成羟基自由基（・oh），破坏eps屏障与细菌细胞膜；

49、4、免疫激活：释放的cu²+/zn²+协同生物膜相关抗原（baas）、双链dna（dsdna），激活cgas-sting与nf-κb通路，诱导巨噬细胞m1极化，增强吞噬功能；

50、5、长期保护：成熟树突状细胞呈递baas，激活t/b细胞，产生特异性抗体，抑制感染复发；

51、6、组织修复：感染清除后，局部ph恢复生理水平，ros减少，m2巨噬细胞上调，促进胶原蛋白沉积与血管新生。

52、（三）有益效果

53、本发明提供了一种代谢响应型全包覆矿化益生菌生物试剂的制备方法和应用。与现有技术相比，具备以下有益效果：

54、1、生物膜清除效率高：体外实验中，llcm对mrsa、大肠杆菌生物膜的破坏率和细菌杀灭率显著优于传统抗生素与单一矿化细菌。

55、2、免疫激活效果显著：体内实验中，巨噬细胞m1极化率提升3倍，炎症因子（tnf-α、il-6、il-1β）表达上调2~4倍，树突状细胞成熟率提升50%，b细胞分化为浆细胞比例增加40%，产生特异性抗体。

56、3、复发率显著降低：手术置换后二次感染模型中，llcm治疗组复发率远低于对照组与单一疗法组。

57、4、生物相容性优异：体外细胞毒性实验（l929、raw264.7细胞）显示，llcm浓度≤500μg/ml时，细胞存活率≥90%；体内实验未观察到心、肝、脾、肺、肾等主要器官损伤。

58、5、组织修复能力强：感染部位cd31（血管新生标志物）表达上调2倍，胶原蛋白i沉积量增加3倍，伤口愈合时间较对照组缩短50%；

59、6、临床转化潜力大：制备工艺温和、可规模化，菌株与材料均符合生物医用标准，适配骨科、心血管等植入物感染场景。