一种ROS响应水凝胶包裹的双靶向修饰核酸-小分子药物组合物及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种ros响应水凝胶包裹的双靶向修饰核酸-小分子药物组合物及其应用。

背景技术：

1、人工关节置换可以改善患者生活质量，提高运动功能，但其远期效果仍面临挑战，其中失用性翻修为患者增加了经济和精神负担。异位骨化（ho）是人工关节置换术后最棘手的并发症之一，指在软组织，尤其是周围的肌肉组织内形成成熟板层骨。人工关节周围异位骨化的发生率为15%-90%，会导致疼痛、关节功能丧失等，需要二次手术进行假体翻修，从而影响人工关节的长期使用效果，增加患者的痛苦和社会经济负担。由于发生机制尚未完全明确，目前缺乏有效的预防方法，是临床迫切需要解决的难题。

2、肌肉组织内药物递送面临多重生理与技术壁垒，严重制约治疗效能。在解剖层面，骨骼肌细胞外基质胶原纤维含量高达25%-30%，形成孔径<50nm的致密网络，使大分子药物（如抗体）扩散系数骤降至水相的1/200，而肌束膜中带负电荷的透明质酸更截留>70%的阳离子载体。动态微环境进一步加剧挑战：高灌注特性导致小分子药物在肌间隙半衰期仅1.2-3.5小时，同时肌细胞高表达的oat3/pept2转运蛋白主动外排60%以上抗生素/抗炎药，缺氧环境则激活组织蛋白酶使蛋白类药物24小时降解率达85%。临床给药方式存在根本缺陷：传统肌内注射形成"药物湖"，80%药液30分钟内经淋巴引流流失，靶细胞摄取率不足5%，迫使给药剂量增至静脉途径的8-15倍，引发18.7%的注射部位坏死及全身毒性。更关键的是精准控制失效：肌肉损伤修复过程中胶原i/iii比例72小时内从1:1剧增至4：1，使同一批次递送系统效能波动达60%，超声引导下仍有42%药液渗漏至非目标肌群，无法区分慢肌（typei）与快肌（type ii）的代谢特性差异，这些困境直接导致近五年74%的肌肉靶向递送临床试验因组织分布不均-疗效波动大而中止。突破路径需双轨并进：一方面采用基质重塑策略，另一方面开发更加合适的载体，在保留肌肉再生功能的前提下实现时空精准干预。

3、前期研究表明，异位骨化与机械刺激和手术创伤引发的炎症反应密切相关。炎症因子会激活肌肉组织中的干细胞进行成骨分化，导致异位骨化。虽然骨科目前普遍采用非甾体类抗炎药例如双氯芬酸、美洛昔康等进行术后预防，但并不能完全防止异位骨化的形成。研究发现力学刺激会直接促进成骨，还会加重炎症反应，然而人工关节在运动过程中产生的力学刺激在异位骨化发生中的作用还尚未充分阐明。为此需要首先明确力学刺激、炎症反应在骨化形成中的相互关系及核心调控分子，然后寻找新的抑制靶点以加强非甾体抗炎药的作用，最后通过局部应用明确其治疗效果，对于人工关节异位骨化的防治、减少二次手术翻修具有重要的理论和应用价值。传统局部注射系统中的药物释放常由被动扩散控制，往往导致脱靶效应，降低疗效，且可能对非靶向组织产生不利影响。为应对上述挑战，构建一种能够实现核酸及小分子药物肌肉组织内递送，稳定性高、转染效率高、具有良好的生物相容性和安全性的纳米药物制剂用于人工关节假体周围异位骨化的治疗具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述不足，本发明的主要目的是提供一种ros响应水凝胶包裹的双靶向修饰核酸-小分子药物组合物，能够实现核酸和小分子药物肌肉组织内递送，稳定性和转染效率高，具有良好的生物相容性和安全性，对人工关节假体植入后的周围软组织异位骨化具有治疗作用。

2、本发明的另一目的是提供所述ros响应水凝胶包裹的双靶向修饰核酸-小分子药物组合物在制备预防和治疗人工关节假体植入后的周围软组织异位骨化的药物中的应用。

3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、本发明的第一方面，提供一种ros响应水凝胶包裹的双靶向修饰核酸-小分子药物组合物，包括ros响应水凝胶、肌肉细胞靶向脂质纳米颗粒（lnp）和巨噬细胞靶向lnp，且三者体积比为11：1：1；

5、所述肌肉细胞靶向lnp和巨噬细胞靶向lnp均为核壳结构的球形lnp；

6、所述肌肉细胞靶向lnp具有肌肉细胞靶向输送功能，其壳结构包括中性磷脂（dspc）、胆固醇（chol）以及肌肉靶向肽（asl）修饰后的聚乙二醇化磷脂（dspe-peg2000-asl）和阳离子脂质（dotap）；内核结构包括针对yap蛋白的核酸分子（si-yap1）、dotap、dspc、chol和小分子药物forskolin；其中dotap、dspc、chol和dspe-peg2000-asl的摩尔比为50：10：38.5：1.5；所述asl肽的序列为asslnia；

7、所述巨噬细胞靶向lnp具有巨噬细胞靶向输送功能，其壳结构包括dspc、chol、叶酸（fa）修饰后的聚乙二醇化磷脂（dspe-peg2000-fa）和dotap；内核结构包括针对cox2蛋白的核酸分子（si-cox2）、dotap、dspc和chol；其中dotap、dspc、chol和dspe-peg2000-fa的摩尔比为50：10：38.5：1.5；

8、所述ros响应水凝胶具有可注射性和ros响应性。

9、作为优选，所述聚乙二醇化磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000、甲氧基-peg-2-豆蔻酸锡酰-3-磷脂乙醇胺中的一种或几种，聚乙二醇化磷脂可以增加纳米颗粒之间的空间位阻，减少脂质体聚集，增强稳定性。

10、作为优选，所述lnp是一种以脂质为主要材料构成的球形纳米粒子，通常认为lnp外层为单层脂质构成，内部由核酸与dotap复合而成的一个个小球，小球之间排列有dspc和chol，lnp表面修饰有dspe-peg2000，增加lnp的稳定性，并减少蛋白吸附。其中，dotap能够通过电荷作用与带负电荷的核酸复合，并在其他脂质成分的帮助下将核酸包裹在lnp的内部，从而大大降低核酸酶的降解作用。同时，dotap所带的正电荷与带负电荷的细胞膜融合，以内吞的方式协助lnp进入细胞，使更多核酸能够被完整地递送到靶细胞，lnp携带的核酸被内吞进入细胞后，dotap与内涵体上的负电荷磷脂相互作用，使内涵体膜从稳定的双分子层状结构转变为不稳定的六边形相，导致内涵体破裂并释放出包裹的核酸，从而使核酸从内涵体中逃逸而免于在溶酶体中被降解。

11、其中，针对cox2蛋白的核酸分子为可调控巨噬细胞极化的si-cox2，调控cox2对巨噬细胞的m1型极化具有良好的抑制作用，并加以fa修饰，对调控炎症环境具有重要意义。针对yap蛋白的核酸分子为si-yap1，yap1作为整合素-yap1通路这一力学传导核心通路中的重要分子，在生理层面适度力学负荷通过整合素-fak信号抑制lats1/2激酶活性，促使yap1去磷酸化入核，与tead结合激活runx2、bmp2等成骨基因，维持骨组织稳态重塑，然而在病理状态下，不正常的力学刺激可以导致肌肉细胞内yap1持续核累积，其转录活性提升，直接驱动三大钙化程序：提升细胞外焦磷酸钙沉积，诱导肌肉细胞col1a1及runx2的表达，激活相关炎症环路，形成力学-yap1-炎症的正反馈。

12、本发明中用于巨噬细胞修饰的是叶酸，其可靶向在巨噬细胞中高度表达的叶酸受体，以达到靶向作用；用于肌肉细胞靶向修饰的是肌肉靶向肽asslnia，两者均可显著提高巨噬细胞及肌肉细胞的lnp摄取效率。

13、本发明中所述小分子药物forskolin是fbxw7的针对性小分子药物，具有良好的维持细胞稳态、抑制细胞不正常凋亡的重要功能，fbxw7作为细胞力学感知的核心调控因子，通过双重机制维系软骨组织的力学稳态。在生理负荷条件下（<0.5 mpa压缩应力），fbxw7持续识别并泛素化降解磷酸化的yap1（ser127位点），有效抑制其核转位及下游促钙化基因（ctgf、ankh）的转录激活；同时通过靶向降解arhgap24，精细调控rhoa/rock信号通路，维持细胞骨架动态平衡与线粒体功能。然而在异位骨化的病理进程中，由于炎症及力学的双重刺激导致肌肉细胞内fbxw7表达显著下调30%-40%，引发双重灾难性后果：一方面yap1/β-catenin异常累积，直接解除对钙化关键酶enpp1的转录抑制；另一方面f-肌动蛋白过度聚合触发ros爆发，激活nlrp3炎症小体并释放il-1β，形成力学失衡-炎症-钙化的恶性循环。靶向恢复fbxw7力学响应功能不仅能阻断yap1核转位，更可逆转病理性钙化微环境，为人工关节异位骨化的精准干预开辟新路径。此外，forskolin具有良好的维持肌肉细胞稳态，与si-yap1共同作用可实现减轻肌肉组织力学刺激响应性的功能，同时该小分子药物与核酸药物共载于同一lnp中，有利于提高lnp载药稳定性，并加以asslnia修饰。

14、本发明中所述ros响应水凝胶是智能生物材料，通过内置ros敏感基团硫醚具有ros浓度响应性和可注射性，实现病灶微环境触发的精准功能调控，核心功能在于按需释放在炎症及损伤部位，水凝胶骨架发生氧化降解或亲疏水性转变，可响应性释放包载的lnp药物，而在正常组织保持稳定。

15、本发明的第二方面，提供所述ros响应水凝胶包裹的双靶向修饰核酸-小分子药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

16、步骤1、采用微流控法制备载有核酸和小分子药物的lnp；

17、步骤2、采用后插法在步骤1所得lnp表面插入dspe-peg2000-fa并超滤，得到巨噬细胞靶向的lnp复合物；

18、步骤3、采用后插法在步骤1所得lnp表面插入dspe-peg2000-asl并超滤，得到肌肉细胞靶向的lnp复合物；

19、步骤4、对步骤2、3所得lnp复合物进行超滤浓缩和ros响应水凝胶包裹。

20、作为优选，步骤1中，所述微流控法制备载有核酸和小分子药物的lnp的步骤包括：

21、（a）将dotap、dspc、chol、dspe-peg2000溶解于乙醇中，作为有机相；将si-cox2溶于ph 4.0的柠檬酸缓冲液中，作为水相；将水相和有机相按照3：1的流速比在微流控芯片中进行混合，得到混合液，室温静置20 min后，将混合液转移至截留分子量为10 kd的透析袋中，按照1：1000的体积比、以ph 7.4磷酸盐缓冲液为介质进行透析，于4℃透析过夜，使ph值从4.0快速提升到7.4，形成lnp-si-cox2复合物，除去未包裹的si-cox2；

22、（b）将dotap、dspc、chol、dspe-peg2000溶解于乙醇中，并向其中加入forskolin-乙醇溶液，作为有机相；将si-yap1溶于ph 4.0的柠檬酸缓冲液中，作为水相；将水相和有机相按照3：1的流速比在微流控芯片中进行混合，得到混合液，室温静置20 min后，将混合液转移至截留分子量10 kd的透析袋中，按照1：1000的体积比、以ph 7.4磷酸盐缓冲液为介质进行透析，于4℃透析过夜，使ph值从4.0快速提升到7.4，形成lnp-forskolin-si-yap1复合物，除去未包裹的sirna及小分子药物forskolin。

23、作为更优选，步骤（a）和（b）中，dotap、dspc、dspe-peg2000、chol的摩尔比均为50：10：1.5：38.5，氮磷比为3.24。

24、作为优选，步骤2中，采用后插法将dspe-peg2000-fa插入到lnp-si-cox2的外表面，用100 kd超滤管超滤以除去未插入到lnp上的dspe-peg2000-fa，得到巨噬细胞靶向的lnp复合物，其中超滤条件为5000×g，4℃，10 min。

25、作为优选，步骤3中，采用后插法将dspe-peg2000-asl插入到lnp-forskolin-si-yap1的外表面，用100 kd超滤管超滤以除去未插入到lnp上的dspe-peg2000-asl，得到肌肉细胞靶向的lnp复合物，超滤条件为5000×g，4℃，10 min。

26、本发明的第三方面，提供所述ros响应水凝胶包裹的双靶向修饰核酸-小分子药物组合物在制备预防和治疗人工关节假体植入后的周围软组织异位骨化的药物中的应用。

27、作为优选，所述药物组合物作用于巨噬细胞和肌肉细胞。

28、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

29、1、本发明提出基于脂质纳米载体的难溶性小分子药物和核酸药物的靶向修饰lnp，具有良好的生物相容性、低细胞毒性、对于核酸药物的高包封率、粒径大小和表面性质（如电荷数、表面修饰靶向肽的数量）易于调控、有利于改善组织穿透能力以及易于实现药物释放速率的调控等特点，得到的ros响应水凝胶包裹的双靶向修饰核酸-小分子药物组合物拥有良好的生物安全性，又保证sirna及疏水性小分子药物的溶酶体逃逸和转染效率。

30、2、本发明选择具有调控巨噬细胞极化功能的核酸药物与维持肌肉组织稳态及对抗不良应力作用的小分子药物的共同递送，从抗炎、维持稳态和抑制不良力学传导三方面共同作用抑制异位骨化的发生，优于单一的抗炎的治疗方式，更贴合临床需求，可以更好实现人工关节假体周围异位骨化的早期防治。

31、3、本发明对lnp为载体的核酸-小分子药物给药体系进行优化，通过添加叶酸及肌肉靶向肽构建双靶向的给药系统，针对人工关节周围异位骨化实现核酸及小分子药物的精准递送，提高其抗炎及稳态维持、抑制成骨效果。

32、4、本发明提供的ros响应水凝胶包裹双靶向核酸-小分子药物给药体系具有良好的生物相容性和安全性，可以通过人工关节假体周围局部注射，实现ros刺激后的响应性释放，将核酸/小分子药物靶向递送到巨噬细胞/肌肉细胞内，从而实现同时抑制炎症和抑制力学传导的角度发挥协同作用，以实现早期防治、干预异位骨化进展的重要目标。