Ankrd1抑制剂在制备治疗软骨炎症药物中的应用

本发明属于生物医学，涉及ankrd1抑制剂在制备治疗软骨炎症药物中的应用。

背景技术：

1、针对关节炎等软骨炎症，现有临床治疗手段主要包括药物治疗和手术治疗。常用药物包括非甾体抗炎药物和糖皮质激素等，然而药物治疗常伴随较为突出的副作用与不良反应。手术虽可对重症患者进行干预，但存在创伤大、术后恢复周期长，还伴随感染风险，部分患者术后仍存在疼痛复发的问题。

2、基因治疗是近年来生物医学领域的研究热点，其关键在于开发安全、高效的基因递送载体。腺相关病毒（aav）因其免疫原性低、能够介导长期基因表达、且不致病等优势，已成为基因治疗中最具应用前景的病毒载体之一。然而，aav病毒存在组织靶向性有限、体内分布特异性不足等问题，限制了其在精准基因治疗中的应用。

3、阳离子脂质体作为一种非病毒载体，具有包封率高、免疫原性低、安全性好、可批量生产等优点。阳离子脂质体可通过静电相互作用包载带负电荷的生物大分子，已被广泛应用于基因转移领域。然而，传统的阳离子脂质体/aav复合物仍存在靶向性不足、体内示踪困难、包封效率有待提高和稳定性欠佳等不足。

4、在关节炎等软骨炎症的靶向治疗中，传统载体无法精准靶向骨髓间充质干细胞，难以实现致病基因的特异性沉默，无法有效干预软骨退变、软骨下骨硬化等核心病理进程，同时缺乏可视化示踪能力，难以精准监测载体在体内的分布与作用效果，极大限制了基因治疗在关节炎治疗中的疗效与应用。

技术实现思路

1、针对上述不足，本发明提供了一种ankrd1抑制剂在制备治疗软骨炎症药物中的应用。本发明创造性地发现，ankrd1抑制剂对软骨炎症具有关键调控作用。本发明研究证实，沉默ankrd1基因能够缓解骨关节炎造成的疼痛，延缓骨关节炎进展，缓解dmm手术造成的软骨下骨硬化。基于上述研究结果，本发明提供了ankrd1抑制剂在制备治疗软骨炎症的药物中的应用，为临床治疗干预软骨炎症提供了新策略。

2、为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供了ankrd1抑制剂在制备治疗软骨炎症的药物中的应用。

4、本发明创造性地发现，沉默ankrd1基因可有效缓解骨关节炎引发的疼痛，延缓骨关节炎的疾病进展，并改善dmm诱导的软骨下骨硬化。基于上述研究发现，本发明提供了ankrd1抑制剂在制备治疗软骨炎症药物中的应用，为软骨炎症的临床治疗干预提供了新的策略。

5、作为对上述应用的第一种限定，所述软骨炎症包括骨关节炎或髌骨软骨软化症中的至少一种。

6、作为对上述应用的第一种限定的进一步限定，所述软骨炎症为骨关节炎。

7、作为对上述应用的第二种限定，所述ankrd1抑制剂包括ankrd1蛋白功能抑制剂或ankrd1基因表达抑制剂中的至少一种。

8、作为对上述应用的第二种限定的进一步限定，所述ankrd1基因表达抑制剂包括靶向ankrd1基因的shrna或针对ankrd1基因的sirna中的至少一种。

9、作为对上述应用的第二种限定的更进一步限定，所述靶向ankrd1基因的shrna的靶基因序列如seq id no.1所示。

10、示例性地，所述靶向ankrd1基因的shrna包括5′端接头序列、shrna茎区正义链序列、环区（loop）序列、shrna茎区反义链序列以及3′端终止序列。

11、第二方面，本发明提供了一种靶向抑制骨髓间充质干细胞ankrd1的递送系统，其包括负载有ankrd1抑制剂的腺相关病毒以及表面修饰eplqlkm多肽的脂质体。

12、作为对上述应用的第一种限定，所述脂质体还带有cy5.5荧光标记。

13、作为对上述应用的第二种限定，所述负载有ankrd1抑制剂的腺相关病毒中含有靶向ankrd1基因的shrna的载体。

14、示例性地，上述靶向抑制骨髓间充质干细胞ankrd1的递送系统的制备方法包括如下步骤：

15、s1.将1,2‑二油酰‑3‑三甲基铵‑丙烷（dotap）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺（dope）、胆固醇、cy5.5标记的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇（dspe-peg-cy5.5）和表面修饰eplqlkm多肽的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇（dspe-peg-eplqlkm）混合，溶于短链醇中，得脂质混合溶液；

16、s2.将载有ankrd1基因的shrna干扰片段的腺相关病毒（记为重组腺相关病毒aav-u6-shrna-cmv-mscarlet-wpre）置于缓冲液中，得重组病毒液后加至所述脂质混合溶液中，混匀，使阳离子脂质体与病毒通过静电相互作用自组装，形成脂质体/aav复合物；

17、s3.将所述脂质体/aav复合物经脂质体挤出器挤出，得靶向抑制骨髓间充质干细胞ankrd1的递送系统。

18、本发明对脂质体‑aav复合载体进行改造，使其兼具干细胞靶向、体内可视化示踪以及高效稳定基因递送的能力，可精准靶向调控骨关节炎关键致病基因，有助于突破骨关节炎基因治疗的技术瓶颈，改善骨关节炎的病理损伤。具体来讲，本发明提供的靶向抑制骨髓间充质干细胞ankrd1的递送系统具有如下优势：

19、（1）具有靶向递送能力：本发明通过在脂质体表面修饰靶向多肽eplqlkm多肽，赋予复合物主动靶向特定组织或细胞的能力，显著提高aav病毒在靶部位的富集效率；

20、（2）活体示踪功能：通过掺入cy5.5荧光标记的dspe-peg-cy5.5，使复合物具备近红外荧光成像能力，可实现体内实时示踪，监测载体的体内分布、代谢过程和靶向效率；

21、（3）高包封率：采用阳离子脂质dotap与aav病毒通过静电相互作用自组装，结合脂质体挤出器均一化处理，aav病毒包封率可达65%以上，显著优于现有方法；

22、（4）优良的粒径和电位特性：所得复合物平均粒径为99~120nm，pdi为0.23~0.25，zeta电位为40.7~43.7mv，具有良好的分散稳定性和均一性；

23、（5）保持病毒活性：ftir表征表明，aav衣壳蛋白的结构在包封过程中未受到破坏，复合物中aav病毒的载体基因组拷贝可达4.70×1011v.g./ml，提示aav颗粒结构得到较好保留；

24、（6）递送系统稳定性佳：通过冻干处理制成固体干粉制剂，可在-20℃避光条件下保存3个月，便于运输和长期储存。

25、示例性地，所述dotap、dope、胆固醇、dspe-peg-cy5.5和dspe-peg-eplqlkm的质量比为12~16:3~7:2~4:1~2:1~2。

26、本发明中dotap为主阳离子脂质提供正电荷；dope辅助脂质膜融合；胆固醇提升囊泡结构稳定性；两种peg脂质基本等量配比，平衡荧光标记与靶向多肽修饰比例，避免单一修饰组分过高导致荧光自猝灭或靶向竞争。

27、示例性地，所述短链醇为甲醇或乙醇中的至少一种。

28、示例性地，所述dspe-peg-cy5.5与dspe-peg-eplqlkm中的peg的分子量为2000da。

29、示例性地，所述重组病毒液与脂质混合溶液的体积比为2.5:1~4:1。

30、示例性地，所述缓冲液为50 mm的柠檬酸盐缓冲液，调节至ph为4，用于分散重组腺相关病毒。

31、弱酸性环境降低aav衣壳负电斥力，增强阳离子脂质静电吸附，大幅提升病毒包封率；ph过高会减弱静电结合，ph过低会造成病毒蛋白变性失活。

32、示例性地，将所述重组病毒液缓慢滴入所述脂质混合溶液，混匀，避光静置18min~25min。

33、18min~25min足够脂质与重组病毒完成静电组装；避光的目的在于防止cy5.5荧光基团光降解；选择滴加的目的在于避免局部浓度过高造成颗粒团聚。

34、示例性地，所述重组病毒液中腺相关病毒滴度为1×1010~1×1012vg/ml。

35、示例性地，所述挤压时，先用500nm和200nm的滤膜进行挤出预处理，后采用孔径为80-120nm的聚碳酸酯膜反复挤出8~12次。

36、控制脂质体流体力学粒径在80nm-120nm，该尺寸适配体内血管循环，不易被毛细血管截留；滤膜孔径过大颗粒不均一，过小易堵塞膜孔、降低制备效率。

37、示例性地，挤出后，经30nm透析膜纯化。该透析膜可截留100 nm左右的脂质体复合物，去除游离脂质、游离重组aav和小分子乙醇等杂质，实现高效纯化。

38、示例性地，将上述制得的透析液冷冻干燥，得靶向抑制骨髓间充质干细胞ankrd1的递送系统。

39、本发明与现有技术相比，具有以下优点和积极效果：

40、本发明创造性地发现ankrd1抑制剂对软骨炎症具有关键调控作用。进一步通过aav负载ankrd1抑制剂后与脂质体自组装以提高其稳定性，而后对脂质体-aav复合载体进行改造，使其兼具骨髓间充质干细胞靶向、体内可视化示踪以及高效稳定基因递送的能力，实现精准靶向调控骨关节炎关键致病基因的目的。

41、经实验验证，本发明提供的靶向抑制骨髓间充质干细胞ankrd1的递送系统能够有效缓解骨关节炎模型小鼠的疼痛、缓解关节炎发展进程、缓解dmm手术造成的软骨下骨硬化、减轻关节软骨损伤并降低oarsi评分。该靶点干预策略为临床干预骨关节炎在内的软骨验证提供了全新的分子机制与治疗思路，在制备防治软骨验证的靶向药物中，具备突出的应用价值与广阔的临床转化前景。