一种富含活性因子的羊胎盘提取物及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术及化妆品原料制备，特别涉及一种富含活性因子的羊胎盘提取物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、胎盘是一种短暂地存在于母体的器官，主要作用是在怀孕期间调节母体和胎儿气体、营养和废物转运。近年来，科学家们针对其生物学特制备出了胎盘提取物。羊胎盘提取物富含氨基酸、生物活性肽、核酸、生长因子等多用活性物质，具有修复组织损伤、美容养颜、抗氧化抗衰、增强免疫力、护肝等功效，长期以来被用作保健食品和化妆品的功能性原料。

2、现有技术中，羊胎盘提取物的制备主要存在以下几种工艺路线，但均存在明显不足。第一种是高温蒸煮或酸碱水解路线，该工艺通常在100 ℃以上长时间处理或采用强酸强碱条件进行水解，虽然能够获得一定量的氨基酸和短肽产物，但热敏性细胞因子（如egf、ngf在60 ℃以上即开始变性）在此过程中完全失活，产物丧失了生物信号调控功能。第二种是传统酶解结合超滤路线，例如已有专利公开的低温蛋白酶水解法，在43 ℃左右酶解1至3小时后通过超滤膜过滤，该工艺虽保留了部分多肽活性，但仅实现了组织蛋白的水解利用，未能针对干细胞来源的细胞因子进行定向富集，产物中细胞因子谱系极不完整。第三种是低温冻融结合离心路线，通过-20 ℃深冻与室温（25~28 ℃）融化的交替处理配合高速离心除杂，虽然能够释放部分胞内蛋白，但无法激活干细胞的分泌功能，内源性细胞因子含量受限于胎盘组织中固有的静态储量，富集效果十分有限。第四种是酶解发酵路线，采用黑曲霉、酵母菌与复合蛋白酶联合发酵，微生物代谢在产生部分水解产物的同时也会消耗营养物质，且发酵产物以水解组织块产生的小分子为主，干细胞来源的旁分泌因子（如外泌体携带的vegf、igf）含量极低。第五种是干细胞单独培养路线，即分离培养胎盘间充质干细胞后收集条件培养基，再经葡聚糖凝胶层析与切向流超滤浓缩，该路线虽可获得白介素、csf、tnf、ifn、egf、tgf等细胞因子，但完全放弃了羊胎盘组织本身的蛋白资源，原料利用率低、成本高、周期长，难以实现产业化应用。

3、虽然已经有现有技术提出采用三联酶分级法解离胎盘组织、并通过体外增殖培养诱导间充质干细胞高表达活性因子的技术方案以实现同时追求组织水解物与干细胞因子的双重利用，但工艺涉及复杂的细胞培养环节，产业化难度非常高，无法真正用于生产。此外，现有低温提取工艺如反复冻融结合双级超滤法，虽能在一定程度上保留活性，但缺乏对干细胞因子的系统性富集手段；而采用ph调节、等电点沉淀及55~65 ℃热处理配合超滤的工艺，则因热处理环节导致部分活性因子失活。

4、综上所述，现有技术尚未建立一种能够在单一工艺链中同时实现羊胎盘组织蛋白的高效酶解利用和内源性干细胞活性因子的最大程度保留与定向富集。随着功效型化妆品和功能性食品市场对全谱系活性因子需求的增长，如何在充分利用羊胎盘组织蛋白资源的同时，高效富集干细胞来源的多种细胞因子，已成为本领域亟待解决的技术空白。

技术实现思路

1、本发明目的在于公开了一种富含活性因子的羊胎盘提取物及其制备方法和应用，以解决现有方法中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

2、为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明第一方面在于提供一种富含活性因子的羊胎盘提取物的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：

4、s1、羊胎盘预处理成胎盘匀浆液；

5、s2、所述胎盘匀浆液过滤去除组织残渣，加入红细胞裂解液，裂解结束后加入至少2倍体积的生理盐水终止反应，1000~1200 rpm离心收集沉淀，用生理盐水重悬后以2000~2500 rpm离心收集沉淀，得到胎盘源活性干细胞群；

6、s3、向所述胎盘源活性干细胞群加入无血清定向激活培养基进行悬浮发酵，定时检测悬浮发酵液中的目标活性细胞因子的浓度，当浓度达到峰值或发酵满48小时终止发酵，所得发酵产物2000~3000 rpm离心收集细胞沉淀，破碎处理所述细胞沉淀后10000~12000 rpm离心收集破碎上清液，与所述发酵产物离心后的上清液合并，得到干细胞源细胞因子富集液；

7、s4、统一收集步骤s2中过滤截留的胎盘组织残渣以及步骤s2各次离心产生的上清液，与所述干细胞源细胞因子富集液合并后在ph 7.5~8.0的条件下加入蛋白酶进行低温酶解，酶解上清液即为所述羊胎盘提取物。

8、所述制备方法通过单一整合工艺同时实现两大核心目标，一方面从新鲜胎盘中分离出内源性干细胞，通过定向悬浮发酵实现活性细胞因子的高效富集，最大程度保留了细胞因子的天然生物活性；另一方面将过滤残渣、离心上清等常规工艺中的废弃物全部回收并酶解利用，充分提取胎盘组织中的蛋白与多肽类营养成分，实现了胎盘原料的全组分高值化利用，避免了分步独立工艺带来的活性损失、物料浪费与生产成本升高的问题。

9、在本发明第一方面的进一步实施方式中，步骤s4所述低温酶解为低温分步酶解处理，包括步骤：

10、（1）加入酶活力≥2500 u/g的胰蛋白酶，于40~42 ℃酶解2~3小时；

11、（2）调节ph至6.5~7.0，加入酶活力≥6000 u/g的木瓜蛋白酶，于50~55 ℃酶解3~5小时；

12、（3）调节ph至7.0~7.5，加入酶活力≥50000 u/g的中性蛋白酶，于45~50 ℃酶解2~3小时；

13、（4）酶解结束后，ph 4.0酸处理灭酶，室温8000~10000 rpm离心，即得所述酶解上清液；

14、酶解全程温度不超过55℃。

15、所述低温分步酶解处理针对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶各自的最适ph与温度条件分段调控，能够最大化发挥各酶的酶解效率，将胎盘组织蛋白与细胞碎片充分降解为小分子活性肽与游离氨基酸，提升酶解产物的皮肤渗透性与生物利用率；同时全程控制酶解温度不超过55 ℃，配合低温酸沉灭酶的方式，避免高温破坏干细胞分泌的活性细胞因子的空间结构与生物活性，实现了酶解效率与活性保留的平衡。

16、在本发明第一方面的进一步实施方式中，步骤s1所述预处理包括：健康绵羊分娩后2小时内完成羊胎盘的采集，用4 ℃预冷的含0.1~0.2%肝素钠无菌生理盐水漂洗至少2次，然后剪成约1 cm3的碎块，加入预冷的含0.5~0.8% d-山梨醇的无菌生理盐水，在匀浆机4~10 ℃的条件下先以2000 rpm匀浆1~2分钟破碎大块组织，再以4000 rpm高速匀浆1~2分钟，即得所述胎盘匀浆液。采集羊胎盘后采用含肝素钠的无菌生理盐水可有效防止血液凝固，更彻底地去除胎盘组织中的残留血液，降低后续红细胞裂解的负担。使用含有d-山梨醇的预冷无菌生理盐水作为渗透压保护剂，能够在匀浆过程中维持细胞渗透压平衡，减少胎盘干细胞的破损与失活，提升后续活性干细胞群的得率与活性。所述匀浆为分段调速的匀浆方式，能充分分散组织块释放细胞，且避免长时间高速匀浆导致的细胞破碎失活。

17、在本发明第一方面的进一步实施方式中，步骤s2中的所述红细胞裂解液包括浓度为0.016mol/l的nh4cl（氯化铵）和浓度为0.017mol/l的tris（三羟甲基氨基甲烷）。所述红细胞裂解液能够在温和的低渗条件下高效裂解去除混杂的红细胞，同时最大程度降低对胎盘干细胞的损伤，保证后续分离得到的活性干细胞群具备良好的增殖与分泌能力。该浓度下的tris-nh4cl接近生理值的ph与渗透压可进一步减少细胞在裂解、洗涤过程中的活性损失，提升最终活性细胞因子的分泌总量。

18、在本发明第一方面的进一步实施方式中，步骤s3中所述悬浮发酵的细胞密度为3×106~5×106cells/ml。所述悬浮发酵需要合适的细胞密度才能避免发酵周期延长、因子分泌总量不足，也防止接种密度过高导致的营养快速消耗、代谢废物积累、细胞活性提前下降，保证细胞因子能够高效、持续地分泌到发酵体系中。

19、在本发明第一方面的进一步实施方式中，步骤s3中所述无血清定向激活培养基包括基础培养基和定向激活组合物，所述基础培养基选自dmem/f12或α-mem，所述定向激活组合物包括egf、bfgf、tgf-β、地塞米松、抗坏血酸磷酸酯、its补充剂、谷氨酰胺、丙酮酸钠和亚硒酸钠。

20、进一步，所述定向激活组合物各组分的浓度为5~15 ng/ml的egf、5~15 ng/ml的bfgf、2~8 ng/ml的tgf-β1、0.05~0.2 μmol/l的地塞米松、50~150 μmol/l的抗坏血酸磷酸酯、标准工作浓度的its补充剂、2~4 mmol/l的谷氨酰胺、1 mmol/l的丙酮酸钠和10~25nmol/l的亚硒酸钠。所述定向激活组合物中的各类生长因子与营养补充剂能够协同作用，定向诱导羊胎盘干细胞高表达、高分泌目标活性细胞因子，同时维持干细胞的未分化状态与高活性，实现活性因子的定向富集。

21、在本发明第一方面的进一步实施方式中，步骤s3中所述悬浮发酵的发酵条件包括37℃、5%co2、饱和湿度、搅拌转速40~80 rpm，发酵时长24~48小时。所述悬浮发酵在低速搅拌条件下进行，以避免细胞贴壁沉降，同时避免搅拌剪切力过大造成细胞损伤。

22、在本发明第一方面的进一步实施方式中，步骤s3中所述破碎处理是以低温冻融处理或低功率超声处理实现，所述低温冻融处理是将所述细胞沉淀冷冻至-20 ℃再回复室温，重复1~2次；所述低功率超声处理是将所述细胞沉淀在冰浴环境下以功率200~400 w，工作5秒间歇5秒，持续处理2~4分钟。两种破碎处理方式均能在低温条件下有效破碎细胞膜，释放胞内储存的活性细胞因子，避免高温、高强度机械破碎带来的蛋白变性与因子失活问题，能够最大程度保留胞内因子的生物活性，且工艺操作简单、参数可控，适合规模化放大生产。

23、本发明第二方面在于提供本发明第一方面所述制备方法制得的富含活性因子的羊胎盘提取物。所述羊胎盘提取物由干细胞发酵液与组织水解液复配共同酶解，因此能够在单一工艺链中同时实现羊胎盘组织蛋白的高效酶解利用和内源性干细胞活性因子的最大程度保留与定向富集。

24、本发明第三方面在于提供本发明第二方面所述羊胎盘提取物的应用方向，具体是用于制备美容产品，使产品具有紧致、抗皱功效。