口腔源性干细胞脱细胞细胞外基质的制备及自噬改性优化

本发明涉及生物医药，具体涉及口腔源性干细胞脱细胞细胞外基质的制备及自噬改性优化。

背景技术：

1、细胞外基质（extracellular matrix, ecm）是细胞生存的天然微环境，主要由胶原蛋白和蛋白聚糖组成，含有大量的生长因子和细胞因子，可调节细胞增殖、迁移、分化和表型表达。ecm作为具有一定组织特异性的非细胞成分，可调节细胞反应并有利于该组织内细胞的存活；同时，ecm可以促进细胞间交流、细胞与ecm之间的相互作用，创造出具有器官和组织特异性的微环境，更有利于器官和组织再生。

2、骨组织工程中常使用合成聚合物和天然衍生的生物大分子制备的水凝胶等作为支架材料促进骨再生。然而，这些材料虽然在动物实验中呈现出较好的促成骨特性，但是在不同物种之间存在明显差异，导致临床效果往往不够理想。即使对人工或天然材料制备的支架材料进行优化改性，其也始终无法完全模拟体内组织的生理微环境，仍然具有免疫原性等不容忽视的局限性。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了自噬改性优化的口腔源性干细胞脱细胞细胞外基质的制备方法及应用。

2、为实现上述目的，本发明提供的具体技术方案如下：

3、本发明第一方面提供了1、一种自噬改性优化脱细胞细胞外基质的制备方法，所述细胞外基质源自口腔源性干细胞，所述口腔源性干细胞选自牙周膜干细胞、牙髓干细胞中的一种或两种；所述制备方法的步骤包括：s1、获取口腔源性干细胞；s2、细胞外基质沉积；s3、脱细胞处理，获得自噬改性优化脱细胞细胞外基质。

4、在本发明中，口腔源性干细胞是指从口腔组织中提取的、具有自我更新能力和多向分化潜能的未分化间充质细胞。包括牙髓干细胞（dpscs）、牙周膜干细胞（pdlscs）、脱落乳牙干细胞（shed）、牙囊干细胞（dfpcs）、根尖牙乳头干细胞（scap）。在本发明的具体实施例中，口腔源性干细胞选自牙周膜干细胞、牙髓干细胞。

5、所述自噬改性通过雷帕霉素实现。

6、雷帕霉素（rapamycin，又名sirolimus）是一种具有多重药理作用的大环内酯类抗生素，最初作为抗真菌药物开发，后因其免疫抑制和抗增殖特性被广泛应用于医学领域。

7、在本发明中，自噬改性是指通过调控细胞自噬过程，改变其活性、选择性或功能，从而优化细胞行为、促进组织修复或治疗疾病的干预手段。在本发明的具体实施例中，自噬改性增强了脱细胞细胞外基质的颌面骨缺损修复能力。

8、在一些实施例中，步骤s1中，获取口腔源性干细胞的步骤包括：牙周膜/牙髓组织剪碎，离心取沉淀，使用i型胶原酶与dispase混合溶液消化1小时，离心取沉淀，使用完全培养基培养，获得口腔源性干细胞。

9、进一步，所述i型胶原酶的终浓度为3 mg/ml。

10、进一步，所述dispase的终浓度为4 mg/ml。

11、进一步，所述离心取沉淀的条件为1100 rpm，5-7分钟。

12、在一些实施例中，步骤s2中细胞外基质沉积的步骤包括：接种细胞至表面预处理的孔板中，使用完全培养基培养，细胞密度为60-80%时进行自噬改性，继续使用完全培养基培养，细胞密度为90-100%后使用ecm沉积培养基培养10天。

13、所述ecm沉积培养基为避光条件下使用完全培养基配制获得250 μm终浓度l-抗坏血酸。

14、进一步，所述自噬改性的步骤为：使用雷帕霉素干预口腔源性干细胞，所述雷帕霉素的浓度为1 nm，干预时长为12小时。

15、进一步，所述表面预处理的步骤包括明胶处理、戊二醛处理、乙醇胺处理，温度为37℃。

16、所述明胶处理为0.2%明胶水溶液覆盖孔板1小时。

17、所述戊二醛处理为1%戊二醛溶液覆盖孔板0.5小时。

18、所述乙醇胺处理为1 m乙醇胺溶液覆盖孔板0.5小时。

19、在本发明中，明胶处理孔板可改善生物相容性、提高表面亲水性、减少非特异性吸附。戊二醛处理可交联固化明胶涂层，降低涂层溶解性与微生物污染风险。戊二醛交联后可能残留未反应的醛基，乙醇胺处理可封闭未反应醛基，减少潜在的细胞毒性，调节表面电荷，参与形成额外交联结构。

20、在一些实施例中，步骤s3中脱细胞处理的步骤包括：使用脱细胞溶液覆盖细胞，至显微镜下无可见完整细胞。

21、所述脱细胞溶液包含0.5%triton-x100和20 mm nh4oh。

22、本发明第二方面提供了一种根据本发明第一方面所述的制备方法制备获得的自噬改性优化脱细胞细胞外基质。

23、本发明第三方面提供了自噬改性优化脱细胞细胞外基质在制备产品中的应用，所述自噬改性优化脱细胞细胞外基质为本发明第二方面所述的自噬改性优化脱细胞细胞外基质。

24、进一步，所述产品为组织工程支架、伤口敷料、药物递送载体或细胞治疗辅助材料。

25、进一步，所述组织工程支架包括骨组织工程支架、软骨组织工程支架、生物墨水。具体地，可用于骨组织修复、软骨组织重建、促进定向分化。

26、进一步，所述伤口敷料包括口腔伤口敷料。

27、本发明第四方面提供了自噬改性优化脱细胞细胞外基质在制备治疗口腔牙槽骨缺损产品中的应用，所述自噬改性优化脱细胞细胞外基质为本发明第二方面所述的自噬改性优化脱细胞细胞外基质。

28、所述产品为组织工程支架、伤口敷料、药物递送载体或细胞治疗辅助材料。

29、本发明的优点和有益效果：本发明提供了自噬改性优化的口腔源性干细胞脱细胞细胞外基质及其制备方法及应用。口腔源性干细胞脱细胞细胞外基质本身已展现出良好的促进成骨分化及骨缺损修复的能力，经过自噬改性处理后，脱细胞细胞外基质的性能得到进一步优化，在骨缺损修复方面表现出更为卓越的效果，为骨缺损治疗材料的研发提供了新的思路和方向。

1.一种自噬改性优化脱细胞细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述细胞外基质源自口腔源性干细胞，所述口腔源性干细胞选自牙周膜干细胞、牙髓干细胞中的一种或两种；所述制备方法的步骤包括：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，获取口腔源性干细胞的步骤包括：牙周膜/牙髓组织剪碎，离心取沉淀，使用i型胶原酶与dispase混合溶液消化1小时，离心取沉淀，使用完全培养基培养，获得口腔源性干细胞；

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中细胞外基质沉积的步骤包括：接种细胞至表面预处理的孔板中，使用完全培养基培养，细胞密度为60-80%时进行自噬改性，继续使用完全培养基培养，细胞密度为90-100%后使用ecm沉积培养基培养10天；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述自噬改性的步骤为：使用雷帕霉素干预口腔源性干细胞，所述雷帕霉素的浓度为1 nm，干预时长为12小时。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述表面预处理的步骤包括明胶处理、戊二醛处理、乙醇胺处理，温度为37℃；

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s3中脱细胞处理的步骤包括：使用脱细胞溶液覆盖细胞，至显微镜下无可见完整细胞；

7.一种根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备获得的自噬改性优化脱细胞细胞外基质。

8.自噬改性优化脱细胞细胞外基质在制备产品中的应用，其特征在于，所述自噬改性优化脱细胞细胞外基质为权利要求7所述的自噬改性优化脱细胞细胞外基质；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述组织工程支架包括骨组织工程支架、软骨组织工程支架、生物墨水；

10.自噬改性优化脱细胞细胞外基质在制备治疗口腔牙槽骨缺损产品中的应用，其特征在于，所述自噬改性优化脱细胞细胞外基质为权利要求7所述的自噬改性优化脱细胞细胞外基质；