一种人脂肪间充质干细胞制剂及其制备方法与流程

本发明涉及可注射脂肪干细胞制剂，尤其属于一种人脂肪间充质干细胞制剂及其制备方法。

背景技术：

1、再生医学领域中，自体脂肪来源间充质干细胞因取材创伤小、免疫原性低、具备多向分化潜能与旁分泌修复功能，已广泛应用于软组织填充、骨关节炎软骨修复、慢性难愈创面治疗、皮肤抗衰等微创临床场景，行业核心需求是开发适配常规门诊注射流程的干细胞制剂，要求制剂质控稳定、储存运输便捷、注射后细胞靶位留存率高、局部不良反应轻微、临床操作简便，可降低场地与人员门槛，支撑规范化临床应用。

2、目前临床应用的可注射脂肪干细胞制剂主要分为两类。第一类是新鲜生理盐水悬浮制剂，将分离扩增后的脂肪间充质干细胞重悬于无菌生理盐水中，现配现用于临床注射，该方案优势是成分简单、无额外外源性添加物、制备流程短，目前在部分临床研究中广泛应用。但该类制剂无原位固定能力，注射后细胞易随组织间隙液、淋巴循环弥散流失，靶位实际留存细胞占比极低，修复效果批次差异大；

3、制剂无专用细胞保护组分，2-8℃冷藏条件下细胞活率衰减快，无法提前批量制备完成全项质控后使用，仅能在具备细胞制备能力的医疗机构现场配制，应用场景受限；此外常规常氧培养的细胞未经过氧化应激预适应，注射到低氧、高炎症水平的损伤部位后，细胞凋亡率高，难以持续发挥修复作用。

4、第二类是深低温冻存干细胞制剂，将脂肪间充质干细胞重悬于含二甲基亚砜冻存保护剂的悬浮液中，经过程序降温后置于液氮环境长期储存，该方案优势是储存周期长，可实现规模化批量化生产、完成质量检定后出库，是当前商业化干细胞产品的主流形式。但该类制剂使用前需快速复融、离心去除冻存保护剂，操作流程繁琐，复融过程易造成细胞机械损伤，活率波动大，残留的冻存保护剂易引发局部刺激、全身不良反应；

5、部分改良方案添加胶原酶消化的脂肪基质成分辅助细胞黏附，但外源性胶原酶残留易诱发局部炎症、异物肉芽肿风险；部分搭载温敏水凝胶的改良方案存在成胶温度不稳定、ph与渗透压偏离生理区间的问题，易出现注射前提前胶凝堵针、注射后成胶过慢细胞流失、基质细胞毒性大等问题，临床操作适配性差，存在安全隐患。

6、随着微创再生医疗的规模化推广，现有制剂方案已无法同时兼顾细胞活性、操作便捷性、生物安全性的多重临床需求，相关技术瓶颈制约了脂肪干细胞制剂的规范化普及，亟需开展针对性的制剂配方与工艺优化。

技术实现思路

1、针对现有可注射脂肪干细胞制剂冷藏活率衰减快、注射后靶位细胞留存率低、临床操作适配性差、易诱发局部炎症的问题，本发明提供了一种人脂肪间充质干细胞制剂及其制备方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种人脂肪间充质干细胞制剂，包含以下组分：p3-p5代人脂肪间充质干细胞、温敏型壳聚糖水凝胶基质、重组人血白蛋白、褪黑素、腺苷、渗透压调节剂，余量为注射用水；制剂在2-8℃条件下为流动的溶胶状态，在32-36℃条件下发生可逆性溶胶-凝胶转变形成半固体凝胶状态，制剂的ph值为7.2-7.4。

3、进一步的，温敏型壳聚糖水凝胶基质由壳聚糖盐酸盐与β-甘油磷酸钠复配得到，壳聚糖盐酸盐与β-甘油磷酸钠的质量比为3:1-4:1，温敏型壳聚糖水凝胶基质在每毫升制剂中的质量体积浓度为1.2%-1.8%。

4、进一步的，重组人血白蛋白的质量体积浓度为0.5%-1.0%每毫升，褪黑素的物质的量浓度为10μmol/l-20μmol/l，腺苷的物质的量浓度为50μmol/l-100μmol/l。

5、进一步的，p3-p5代人脂肪间充质干细胞的细胞表型满足：cd73、cd90、cd105的阳性表达率不低于95%，cd34、cd45、hla-dr的阳性表达率不高于2%，制剂中的细胞活率不低于95%；渗透压调节剂为药用级氯化钠，用于将制剂的渗透压调节至280-320mosm/l的等渗范围。

6、进一步的，每毫升制剂中还包含质量体积浓度为0.1%-0.3%的人脂肪基质微片段，人脂肪基质微片段为自体来源，是从对应捐赠者的脂肪抽吸物中经物理剪切、梯度过滤去除成熟脂肪细胞与血细胞后得到的粒径为100μm-200μm的基质片段，人脂肪基质微片段制备过程中未使用外源性胶原酶，无胶原酶残留。

7、进一步的，一种人脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：

8、s1、人脂肪间充质干细胞的分离培养：取经伦理审批和捐赠者知情同意的人脂肪抽吸物，经无菌磷酸盐缓冲液反复振荡洗涤去除血细胞和游离脂质，加入等体积的质量体积浓度0.1%的i型胶原酶溶液在37℃条件下振荡消化30min-40min，消化完成后经100μm细胞筛过滤去除未消化组织，滤液离心获得基质血管组分沉淀，将沉淀重悬接种于无血清间充质干细胞完全培养基中，置于37℃、体积分数5%二氧化碳的常氧培养箱中进行原代培养，待细胞融合度达到80%-90%时采用质量体积浓度0.05%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液消化传代，连续传代培养至p3-p5代，收获细胞备用；

9、s2、温敏水凝胶基质母液的配制：将药用级壳聚糖盐酸盐溶解于无菌注射用水中，制备成质量体积浓度为3%-4%的壳聚糖盐酸盐水溶液，经121℃高压蒸汽灭菌20min后冷却至4℃备用；将药用级β-甘油磷酸钠溶解于无菌注射用水中，制备成质量体积浓度为20%的β-甘油磷酸钠水溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌后冷却至4℃备用；在无菌、冰浴条件下将β-甘油磷酸钠水溶液逐滴加入到壳聚糖盐酸盐水溶液中，边加边搅拌，混合均匀后得到温敏型壳聚糖水凝胶基质母液，置于4℃环境下保存备用；

10、s3、基质混合液的配制：将药用级重组人血白蛋白、褪黑素、腺苷、渗透压调节剂分别用无菌注射用水溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌后，按照预设配比逐滴加入到4℃预冷的温敏型壳聚糖水凝胶基质母液中，边加边轻轻搅拌混匀，得到基质混合液，置于4℃环境下放置脱气备用；

11、s4、制剂成品配制：将步骤s1收获的p3-p5代人脂肪间充质干细胞用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液反复洗涤2次-3次去除残留培养基成分，然后用4℃预冷的基质混合液重悬细胞，调整细胞密度，补充4℃预冷的无菌注射用水定容至目标体积，轻轻吹打混匀后即得人脂肪间充质干细胞制剂成品，密封后置于2-8℃冷藏条件下保存。

12、进一步的，步骤s1中还包括人脂肪基质微片段的制备过程：取部分经洗涤去除血细胞和游离脂质的脂肪抽吸物，在无菌条件下采用无菌机械剪切装置反复剪切至均匀组织糜状，依次经200μm孔径、100μm孔径的无菌细胞筛过滤，采用无菌磷酸盐缓冲液反复冲洗筛网，收集截留在100μm孔径细胞筛上的组织片段，再次经磷酸盐缓冲液离心洗涤去除残留的游离血细胞和成熟脂肪细胞，得到粒径分布在100μm-200μm的人脂肪基质微片段；在步骤s4配制制剂成品时，将人脂肪基质微片段按照预设配比加入到基质混合液中，与重悬的人脂肪间充质干细胞共同轻轻混匀。

13、进一步的，步骤s1中，当传代培养的p2代细胞融合度达到60%-70%时，将细胞转移至氧浓度为5%、二氧化碳浓度为5%、温度为37℃的低氧培养箱中进行预适应培养24h-48h，预适应培养期间不更换培养基；预适应培养结束后，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞1次，加入质量体积浓度0.05%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液在37℃条件下消化2min-3min，待细胞边缘变圆开始脱落时，加入含质量体积浓度0.02%重组人胰蛋白酶抑制剂的无菌磷酸盐缓冲液终止消化反应，吹打收集细胞悬液，离心获得细胞沉淀用于后续制剂配制。

14、进一步的，步骤s3中，在各组分加入完成后，对基质混合液的关键参数进行检测与调整：采用恒温水浴法检测基质混合液的胶凝温度，调整β-甘油磷酸钠的加入量，使得基质混合液的胶凝温度稳定在32-36℃范围内；采用无菌的0.1mol/l稀盐酸溶液或0.1mol/l氢氧化钠溶液调节基质混合液的ph值，使ph值稳定在7.2-7.4范围内；采用渗透压仪检测基质混合液的渗透压，调整氯化钠的加入量，使得基质混合液的渗透压稳定在280-320mosm/l的等渗范围内。

15、进一步的，步骤s4中，细胞重悬后调整人脂肪间充质干细胞的密度为1×10^6个/ml-5×10^6个/ml，制剂配制完成后，在2-8℃的无菌环境下将制剂分装为2ml/支的独立包装单元，分装过程中避免产生气泡，分装完成后立即采用无菌胶塞密封铝盖压口，置于2-8℃恒温冷藏设备中储存，储存过程中避免反复晃动和温度剧烈波动，制剂无需添加二甲基亚砜类冻存保护剂，无需冷冻保存，取出后直接用于临床注射。

16、本发明具有如下有益效果：

17、本发明通过添加适配脂肪干细胞生理耐受阈值的等渗保护组分与氧化预适配缓冲体系，大幅延缓常规医用冷藏条件下的细胞活率衰减速率，制剂完成制备后可在标准冷藏环境下稳定存放，支持提前完成全项质量检定后再配送至临床使用，无需医疗机构配套专属细胞制备场地与专职制备人员，有效解决了现有新鲜悬浮制剂冷藏活率衰减快、应用场景受限于院内细胞制备能力、无法实现标准化质控出库的缺陷。

18、本发明通过复配具备精准成胶阈值的温敏基质组分，制剂在常规注射操作温度下保持低黏度流畅液态，进入体内达到生理体温区间后快速形成贴合注射腔隙的多孔三维支架，可物理锚定脂肪干细胞减少其随组织液弥散流失，结合制剂组分介导的细胞氧化应激预适应作用，可提升细胞在低氧、高炎症损伤微环境中的耐受能力，降低注射后细胞原位凋亡率，支持细胞持续释放旁分泌修复因子发挥组织修复作用，有效解决了现有制剂靶位细胞留存率低、修复效果批次波动大的缺陷。

19、本发明所用温敏基质组分均为生物相容性良好的可降解医用材料，配方为等渗无细胞毒性体系，不引入外源性胶原酶残留与具有局部刺激性的冻存保护剂组分，成胶参数与常规临床注射器推注压力、门诊标准操作流程高度适配，不会出现提前胶凝堵针、注射后成胶滞后的问题，注射后局部异物刺激与炎症反应风险低，有效解决了现有冻存制剂操作繁琐、保护剂残留易引发不良反应，现有温敏水凝胶制剂成胶稳定性差、易堵针、易诱发局部肉芽肿的缺陷。

20、该制剂可适配软组织填充、软骨修复、慢性难愈创面治疗等多场景的门诊微创注射需求，支持规模化、标准化生产质控全流程，降低脂肪干细胞临床应用的场地与人员门槛，适配各级医疗美容、骨科、创面修复科室的常规操作流程，具备良好的行业推广价值。