亚胺还原酶突变体及其在合成(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷中的应用的制作方法

技术特征：
1.亚胺还原酶突变体，其特征在于：与氨基酸序列seq id no：1相比，存在残基差异包括a92、d112、q189、q137、y220、v248、m253、f295中的一个或多个。2.根据权利要求1所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述残基差异包括a92w、d112v\s、q189m、q137r\a、y220q、v248n、m253a\s、f295w中的一个或多个。3.根据权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述残基差异还包括s227q、g252c中的一个或多个。4.根据权利要求4所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述残基差异还包括p179c、i222c\n中的一个或多个。5.根据权利要求4所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：氨基酸序列选自seq id no：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97或99。6.一种制备(r)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷酮的方法，其特征在于：如权利要求1至5任意一项所述的亚胺还原酶突变体催化底物ix为化合物i7.根据权利要求6所述的制备(r)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷酮的方法，其特征在于：将化合物ix、辅酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、亚胺还原酶突变体混合进行反应得到化合物i；进一步，所述辅酶为nadp；进一步，所述化合物ix与亚胺还原酶突变体的质量比为1～10:1；进一步，所述辅酶与亚胺还原酶突变体的质量比为0.01～0.1:1；进一步，所述葡萄糖与亚胺还原酶突变体的质量比为2～20:1；进一步，所述葡萄糖脱氢酶与亚胺还原酶突变体的质量比为0.1～0.5:1；进一步，反应条件为磷酸盐调节ph6～7，反应温度为20～30℃，搅拌速度为250～350。8.一种核酸，其特征在于：所述核酸可以编码权利要求1至5中任一项所述的亚胺还原酶突变体。9.一种表达载体，其特征在于：包括权利要求8的核酸。10.一种细胞，其特征在于：包括权利要求8的核酸或权利要求9的载体。11.一种如权利要求1至5中任意一项的亚胺还原酶突变体的生产方法，其特征在于培养权利要求10中所述的细胞得到所述的亚胺还原酶突变体。12.如权利要求11所述的生产方法，其特征在于所述的亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达。13.如权利要求12所述的生产方法，其特征在于：用同时含有亚胺还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶基因的细胞生产共表达酶。14.如权利要求13所述的生产方法，其特征在于：通过带有限制性内切酶位点的引物将葡萄糖脱氢酶基因从pet30a-gdh载体上扩增下来。分别用限制性内切酶bamhi和xhoi对带
有权利要求1-5所述的亚胺还原酶突变体基因片段的pet30a-ired载体和扩增获得的带有rbs位点的葡萄糖脱氢酶基因片段进行双酶切，胶回收酶切片段，并用t4 dna连接酶连接后转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，获得同时含有亚胺还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组菌。15.通过权利要求11-14任意一项所述的生产方法制备得到的亚胺还原酶突变体或者亚胺还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的共表达酶。16.如权利要求15所述的共表达酶的应用，其特征在于：共表达酶催化底物ix为化合物i17.一种如权利要求16所述的共表达酶的应用，其特征在于：将化合物ix、辅酶、葡萄糖、共表达酶混合进行反应得到化合物i；进一步，所述辅酶为nadp；进一步，所述化合物ix与共表达酶的质量比为10:1；进一步，所述辅酶与共表达酶的质量比为1:10；进一步，所述葡萄糖与共表达酶的质量比为20:1；进一步，反应条件为磷酸盐调节ph6～7，反应温度为20～30℃，搅拌速度为250～350。

技术总结
本发明公开了一种亚胺还原酶突变体以及这种亚胺还原酶用于制备化合物I(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的方法。将来源于乳类芽孢杆菌(Paenibacillus lactis)的野生型亚胺还原酶的编码基因SEQ ID NO:1经重组后得到本发明的亚胺还原酶突变体，提高了使用酶催化的转化率，提高了ee值。另外本发明公开了一种亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达体系，不需要单独制备葡萄糖脱氢酶，节省了成本。节省了成本。节省了成本。


技术研发人员：陈泽聪
受保护的技术使用者：陈泽聪
技术研发日：2021.08.06
技术公布日：2023/2/17