一株地衣芽孢杆菌及其应用

(3-isopropylhexahydro-4h-pyrido[1,2-a]pyrazine-1,4(6h)-dion)。
[0009]
该化合物的分子质量为211.14410，这是第一个从微生物代谢中分离出的化合物。本发明的研究结果表明，该化合物针对p.aeruginosa的mic和mbc分别在 13
±
0.17mg/l和22
±
0.7mg/l之间，高浓度下对p.aeruginosa具有很强的抗菌作用。进一步的抗菌测试表明，在0.5
×
mic下该化合物可以干扰铜绿假单胞菌的信号传导，毒力因子的释放。在1
×
mic下可以抑制铜绿假单胞菌的生长，在1
×
mbc可以根据剂量和时间的模式迅速杀灭铜绿假单胞菌。
[0010]
该化合物的表征测定图谱：
[0011]
高效液相色谱分析图谱：见6a；
[0012]
傅里叶红外光谱仪分析图谱：见6b；
[0013]
gc-ms分析图谱：见6c；
[0014]
高分辨质谱分析图谱：见6d；
[0015]
核磁共振分离图谱：见6e。
[0016]
其中，所述代谢产物的形式不受特别的限制，只要其含有3-异丙基六氢-4h-吡啶 [1,2-a]吡嗪-1,4(6h)-二酮即可。例如，其可以为所述地衣芽孢杆菌的发酵液、发酵上清液、发酵上清液的提取物等。
[0017]
根据本发明一种具体的实施方式，所述提取物可以为粗提物也可以为纯化物。
[0018]
其中，所述提取物的制备方法优选包括：
[0019]
(1)在培养基中培养如上所述微生物得到含有所述化合物发酵产物；
[0020]
(2)从所述发酵产物中分离并可选地提纯所述化合物。
[0021]
本发明中，所述培养基的种类不受特别的限制，只要能够使得所述微生物生长繁殖并有效合成所述化合物即可。根据本发明一种优选的实施方式，所述培养基选自bhi肉汤培养基。这些培养基均可以通过商购获得，本发明在此不再对其具体组成进行阐述。
[0022]
本发明中，所述培养的条件不受特别的限制，只要能够使得所述微生物生长繁殖并有效合成所述化合物即可。根据本发明一种优选的实施方式，所述培养的条件能够使得所述微生物合成的所述化合物分泌到发酵液中。更优选的，所述培养的条件包括：温度为30-90℃，优选为50-60℃，例如55℃；时间为24-100小时，优选为60-80小时，例如，72h。进一步优选的，所述培养在有氧的条件下进行，例如，通过摇床培养的方式。
[0023]
本发明中，所述微生物的接种量也不受特别的限制，例如，可以按照8-12体积％的比例将所述微生物接种至培养基中。
[0024]
本发明中，优选的，从所述发酵产物中分离并可选地提纯所述化合物的方法包括：
[0025]
(21)将所述发酵产物进行固液分离，得到发酵上清液；
[0026]
(22)将所述发酵上清液与乙酸乙酯接触，并在0-10℃的条件下对所述化合物进行低温提取，得到含有所述化合物的粗提液；
[0027]
可选的，该方法还包括去除所述粗提液中的乙酸乙酯；
[0028]
进一步可选的，该方法还包括去除所述粗提液中的乙酸乙酯，然后将所得物料进行干燥，得到所述化合物的粗提粉；
[0029]
(23)将所述粗提液或者所述粗提粉的溶解液依次进行硅胶柱层析和反向c18硅胶柱洗脱，得到所述化合物。
[0030]
步骤(21)中，在没有相反说明的情况下，术语“发酵产物”为发酵液，其包括发酵菌体和发酵清液。
[0031]
对所述发酵产物进行固液分离的方法不受特别的限制，只要能够有效的将发酵菌体从发酵液中分离出去即可，例如，可以采用离心、过滤等常规的方法。根据本发明一种具体的实施方式，可以在10,000-15,000rpm下离心5-20min来获得发酵清液。
[0032]
步骤(22)中，所述乙酸乙酯的用量可以在较宽的范围改变，只要能够对所述化合物进行有效提取即可。优选的，相对于1体积份的所述发酵清液，乙酸乙酯的用量为0.5-2 体积份，更优选为0.8-1.2体积份，进一步优选为等体积混合。
[0033]
所述提取可以在提取罐中进行。
[0034]
其中，所述提取的时间不受特别的限制，优选的，所述提取的时间为8-20小时，更优选为10-15小时。
[0035]
其中，为了便于后续操作，增加所述化合物的纯度和得率，优选的，在提取结束后该方法还包括去除乙酸乙酯的步骤，例如，可以在旋转蒸发仪中通过蒸发将乙酸乙酯去除。
[0036]
其中，为了便于保存，优选的，在去除乙酸乙酯后，该方法还包括将所得物料进行浓缩干燥，得到粗提粉。所述浓缩的方法可以为真空浓缩。所述干燥可以为冷冻干燥，例如，在冻干机中进行。
[0037]
步骤(23)中，优选的，所述硅胶柱层析的方法包括：
[0038]
(i)采用湿法填柱干法上样，将硅胶和chcl3混合均匀，沿着层析柱(缓慢)加入使得硅胶在柱体里面沉淀均匀无气泡，使用chcl3为流动相多次冲洗柱体使硅胶沉淀均匀；
[0039]
(ii)在所述粗提液或者所述粗提粉的溶解液中加入50-100目硅胶粉于获得的澄清液体，旋转蒸发成干粉，将其均匀填在硅胶柱柱头；
[0040]
(iii)使用chcl3和甲醇作为洗脱剂洗脱获得不同分级馏份，并测试抗菌活性。
[0041]
其中，步骤(ii)中，优选的，采用所述粗提粉的溶解液作为样本，更优选所述粗提粉的甲醇溶液。能够理解的是，将所述粗提粉溶解后可能会形成部分的不溶液，这可以通过离心或者过滤的方法将不溶物分离出去。
[0042]
其中，所述硅胶粉的加入量不受特别的限制，优选的，相对于10g的澄清液体，所述硅胶粉的加入量为10-20g，优选为12-18g，更优选为15g。
[0043]
其中，步骤(iii)中，作为洗脱剂的流动相在对有效成分进行洗脱时，可以按照常规的操作，例如，使用chcl3 甲醇为流动相配比梯度洗脱获得不同分级馏份。
[0044]
其中，通过测试抗菌活性，选择抗菌活性最高的馏分进行下一步的分离。
[0045]
在一些实施方式中，所述反向c18硅胶柱洗脱的方法包括：
[0046]
(a)采用湿法填柱湿法上样，甲醇浸泡c18 18-30h使碳链完全展开，沿层析柱加入使得c18在柱体内沉淀均匀无气泡，以甲醇为流动相冲洗柱体多次，使硅胶沉淀均匀；
[0047]
(b)将正向硅胶获得的粗提物溶于洗脱液(甲醇：水＝1:1)，弃不溶物，将获得的澄清液体均匀填在硅胶柱柱头；
[0048]
(c)使用水和甲醇为流动相洗脱获得不同分级馏份，并测试抗菌活性。
[0049]
同样的，作为洗脱剂的流动相在对有效成分进行洗脱时，可以按照常规的操作，例如，使用水和甲醇为流动相配比梯度洗脱获得不同分级馏份。
[0050]
其中，通过测试抗菌活性，选择抗菌活性最高的馏分作为所述化合物的纯化物。
[0051]
本发明的第三个目的在于提供如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的产品组合物在抑菌中的应用。
[0052]
例如，可以在体外使用所述地衣芽孢杆菌或如上所述产品组合物进行抑菌。
[0053]
根据本发明一种实施方式，所述应用为非治疗目的应用。
[0054]
其中，对于可抑制的菌体不受特别的限制，只要所述菌体的生长、繁殖、代谢或其他生命活动能够受到所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的产品组合物的干扰即可。根据本发明一种优选的实施方式，所述菌体选自金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，紫色杆菌梭状芽胞杆菌，肠炎沙门氏菌和铜绿假单胞菌。
[0055]
本发明的第四个目的在于提供如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的产品组合物在制备用于抑菌的产品中的应用。
[0056]
其中，对于可抑制的菌体不受特别的限制，只要所述菌体的生长、繁殖、代谢或其他生命活动能够受到所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的产品组合物的干扰即可。根据本发明一种优选的实施方式，所述菌体选自金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，紫色杆菌梭状芽胞杆菌，肠炎沙门氏菌和铜绿假单胞菌。
[0057]
本发明的第五个目的在于提供如上所述的地衣芽孢杆菌或权如上所述的产品组合物在抑制生物膜形成中的应用。
[0058]
研究证明，本发明提供的化合物还够干扰细胞对信号因子的应答并抑制毒力因子的生成阻止生物膜的形成。具体的，0.5xmic提取物抑制pa生物膜形成，sem和afm图像表明，与对照组相比，添加本发明提供的化合物的生物膜拓扑结构发生了明显变化，实验组中生物膜变得疏松而对照组平整光滑，对于已经形成的生物膜，添加提取物后能导致生物膜的撕裂及穿孔，最终导致膜被破坏。
[0059]
本发明的第六个目的在于提供如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的产品组合在抑制紫色杆菌对信号因子乙酰基高丝氨酸内酯的应答中的应用。
[0060]
本发明的第七个目的在于提供如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的产品组合物在抑制紫红素中的应用。
[0061]
本发明可取得如下的有益效果：
[0062]
在高浓度下qx8代谢产物对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，梭状芽胞杆菌，肠炎沙门氏菌，铜绿假单胞菌均表现出杀伤作用并呈现剂量依赖。qx8纯化物能抑制紫色杆菌对信号因子乙酰基高丝氨酸内酯的应答，在另一项测试中qx8纯化物对紫红素产生了明显的抑制作用。在测试的最高抑制浓度达到96％。在本研究中，化合物纯化后通过高分辨质谱，核磁共振，气质联用，傅里叶红外，高效液相色谱后化合物被鉴定为3-异丙基六氢-4h-吡啶[1,2-a]吡嗪-1,4(6h)-二酮，分子质量为211.14410，这是第一个从微生物代谢中分离出的化合物。本发明的研究结果表明，针对p.aeruginosa的mic和mbc分别在13
±
0.17mg/l和22
±
0.7mg/l之间，高浓度下对p.aeruginosa具有很强的抗菌作用。进一步的抗菌测试表明，在0.5
×
mic下qx8纯化物可以干扰铜绿假单胞菌的信号传导，毒力因子的释放。在1
×
mic下可以抑制铜绿假单胞菌的生长，在1
×
mbc可以根据剂量和时间的模式迅速杀灭铜绿假单胞菌。
[0063]
在低浓度下地衣芽孢杆菌qx8产生的化合物还能够干扰细胞对信号因子的应答并抑制毒力因子的生成阻止生物膜的形成。研究结果表明提取物能物阻碍铜绿假单胞菌 qs
调节级联反应。如上所述，0.5xmic提取物抑制pa生物膜形成。sem和afm图像表明，与对照组相比，添加qx8纯化物的生物膜拓扑结构发生了明显变化，实验组中生物膜变得疏松而对照组平整光滑，对于已经形成的生物膜，添加提取物后能导致生物膜的撕裂及穿孔，最终导致膜被破坏。破坏生物膜结构是抑制耐药p的生物膜形成的一个有希望的战略。涌动细运动在铜绿假单胞菌的生物膜形成过程中扮演了重要的角色，为了让细菌形成生物膜，它们需要附着在表面，一旦附着在表面，细菌通过成群结队和游泳类型的活动传播，最终导致在生物或非生物表面形成生物膜，诱发持续的感染。在 qx8纯化物提取物的存在下观察到pa的蜂群和游泳活动均被抑制。sj16提取物可能也有能力阻止p的初始附件。通过防止细菌向表面移动。这一过程有可能为阻止细菌传播开辟新的途径，从而最大限度地降低微生物形成生物膜的能力。
[0064]
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
[0065]
生物保藏
[0066]
地衣芽孢杆菌
[0067]
本发明的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)，于2021年11月15日被保藏在广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所，邮编510070)(保藏单位的缩写为gdmcc)，保藏编号为gdmcc no. 62062，简称qx8。
附图说明
[0068]
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。
[0069]
图1为qx8在电子显微镜下菌体形态；
[0070]
图2为由16s rrna序列比对建立的系统发育树；
[0071]
图3为乙酸乙酯萃取qx8培养基，水洗后的提取物的抗菌活性；
[0072]
图4为qx8粗提物的热稳定性随着温度上升的变化；
[0073]
图5(a)为粗提物纯化后重结晶后的图片；
[0074]
图5(b)为硅胶板碘显色验证图片；
[0075]
图6为qx8提取物表征测定的图谱；(a)高效液相色谱分析、(b)傅里叶红外光谱仪分析(c)、gc-ms分析、(d)高分辨质谱分析、(e)核磁共振分离；
[0076]
图7为qx8提取物的抗群体效应；(a)提取物在0.2xmic浓度下干扰紫色色杆菌cv026对高丝氨酸内酯的响应；(b)阳性对照肉桂醛和阴性对照甲醇；(c)不同浓度qx928 提取物对紫胶素浓度的影响；
[0077]
图8为qx8提取物对铜绿假单胞菌细胞活力和生物膜拓扑结构的影响(a)显微显微镜下的生物膜结构；(b)原子力显微镜下的生物膜结构；(c)电子显微镜下的生物膜结构；
[0078]
图9为qx8提取物对铜绿假单胞菌的影响；其中，(a)qx8提取物(mic＝13
±ꢀ
0.17mg/l)对铜绿假单胞菌细胞运动和涌动的影响；(b)qx8提取物(mic＝13
±
0.17mg/l) 对pa毒力因子的干扰；(c)qx8提取物(mic＝13
±
0.17mg/l)对铜绿假单胞菌能量代谢的 干扰；
[0079]
图10为qx8提取物对细胞膜通透性的影响。
具体实施方式
[0080]
以下的制备例、实施例和对比例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
[0081]
实施例1
[0082]
本实施例用于说明本发明提供的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的获得
[0083]
1.1温泉嗜热菌的富集与分离
[0084]
采集中国西南部绵阳安县生物礁国家地质公园五个主要温泉(北纬n104
°
35
′
09.9”，东经e31
°
58
′
83.6”)，使用无菌容器收集温泉水样。样品距离岸边2m，深度40cm。远离边缘以便成为代表性样本。4℃保存样品运送到至实验室，实验室中测量温泉盐度和ph 等理化参数后，0.45mm膜过滤样品，将滤膜置于胰蛋白酶大豆肉汤(tsb)50℃-90℃培养。每10℃设置一个梯度共5组，摇床转速160r/min孵育3d。取1ml富集液无菌水稀释为10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
浓度梯度，均匀涂布在lb/tsa/bhi/ma固体平板上， 50℃-90℃，继续培养3-5d，观察和归类平板上生长的菌落形态，挑取具有代表性的菌落，划线法纯化、标记和保藏菌株，共得到247个菌株。
[0085]
1.2具有抗菌活性菌的筛选
[0086]
将纯化后的单菌接种于bhi肉汤中，50℃-90℃、160prm摇床培养72h，每10℃设定一个梯度。同时将实验室保存的铜绿假单胞菌，梭状芽孢杆菌，肠炎沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌分别接种于lb液体培养基中活化培养12h，活化后取50μl涂布于 lb平板，将嗜热菌发酵菌液10,000
×
g离心15min的无细胞上清液(cfs)加入牛津杯用于分析筛选抗菌活性。将牛津杯放入涂布有致病菌的平板并在其中加入50μl无细胞上清液，37℃下孵育24h后观察抑菌圈，有抑菌圈产生的则初步推断该菌能产生抗菌活性物质(每组实验重复三次)。
[0087]
共筛选到13株具有抗菌活性菌株，上清液表现出单一或者广谱抗菌活性，抗菌活性如表1所示。
[0088]
表1具有抗菌活性菌株编号
[0089]
[0090][0091]
其中菌株qx8，qx13，qx31，qx51，qx137对5种实验菌均呈现出抗菌阳性，其中菌株qx8的抑菌圈最大，故将qx8作为标的菌株进行菌株鉴定及后续研究。
[0092]
1.3菌株代谢鉴定
[0093]
对qx8进行代谢鉴定，实验表明qx8具有抗菌活性，对常见致病菌具有广谱抗菌活性，qx8为革兰氏阳性，不运动，不溶血，测定其过氧化氢酶，蛋白酶和磷脂酶为阴性，在电子显微镜下菌体形态如图1所示。
[0094]
1.4菌株的16s rna 初步鉴定
[0095]
将温泉中分离到的具有抗菌活性的菌株接种于tsa培养基中，160r/min摇床，55℃下培养24h，16s rna序列扩增引物为1492r(5’acgghtaccttgtttacgactt-3’，seqid no:1)和27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’，seq id no:2)，pcr反应扩增体系如表2所示。
[0096]
表2 pcr反应扩增体系
[0097][0098]
pcr反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共 30个循环；72℃最后延伸5min，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，预期产物大小在 1500bp左右，委托北京博迈德有限公司测序。
[0099]
分析由16s rrna序列比对建立的系统发育树(如图2所示)可知，菌株qx8与b.tequilensis的关联最大，有99％相似性，表明菌株qx8为地衣芽孢杆菌，将qx8的 16s rrna序列提交到genbank中，登录号为mk994992。
[0100]
1.5菌株保藏
[0101]
将菌株qx8于2021年11月15日被保藏在广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所，邮编510070)(保藏单位的缩写为gdmcc)，保藏编号为gdmcc no.62062，简称qx8。
[0102]
实施例2
[0103]
本实施例用于说明菌株qx8粗提物的制备
[0104]
将基本发酵培养基接种活化的地衣芽孢杆菌qx8，55℃摇床培养72h，12,000r/min 离心10min获得无细胞上清液。将上清液与等体积乙酸乙酯混合后在单独的提取罐中， 4℃孵育过夜。然后将乙酸乙酯在旋转蒸发仪中蒸发，真空浓缩器浓缩剩余的残余物后，冻干机
冻干，即获得粗提取物。
[0105]
实施例3
[0106]
本实施例用于说明筛选得到的菌株qx8的性能
[0107]
3.1抗菌活性的评价
[0108]
将铜绿假单胞菌，肠炎沙门氏菌，梭状芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌稀释至od
600
＝0.1，将每种菌加入96孔板(每菌一排孔)，每排第一个孔中加入20mg/ml粗提物(蒸馏水溶解)并每孔依次梯度稀释，37℃下培养24h观察细菌生长情况，每菌重复三次。结果如图3所示。
[0109]
由图3可以看出，乙酸乙酯萃取qx8培养基，水洗后的提取物具有广谱抗菌活性，可明显抑制铜绿假单胞菌，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌，金黄色葡萄球菌的生长。
[0110]
3.2抗菌活性物质稳定性评估
[0111]
抗菌活性物质的稳定性在应用方面有着重要的作用，本研究通过不同温度条件处理来评估qx8粗提物的热稳定性。具体步骤如下：
[0112]
(1)将提取后的qx8再次溶解于甲醇中进行二次纯化，除去不容固体颗粒离心后获得深红色透明液体；
[0113]
(2)旋转蒸发获得固体颗粒，将固体分别放置于55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃处理24h，每隔30min取20mg溶解于1,000ml蒸馏水中，测定其抗菌活性；
[0114]
(3)以铜绿假单胞菌实验菌，过夜培养后1:300稀释于lb培养基中。取50μl涂布于lb平板上，牛津杯置于平板上，在牛津杯中加入步骤2粗提物配置的溶液；
[0115]
(4)将上述平板37℃下培养24h，以抑菌圈大小评估qx8粗提物的热稳定性大小，结果如图4a所示。
[0116]
由图4a可以看出，qx8粗提物的热稳定性随着温度的上升而降低，3.5h内80℃下处理后的提取物仍能具有有效的抗菌活性，表明qx8粗提物具有良好的热稳定性。
[0117]
实施例4
[0118]
本实施例用于说明抗菌活性物质的纯化
[0119]
4.1抗菌活性粗提物组分测定
[0120]
将实施例2经水系冻干后获得的粗提物溶于甲醇后，使用gc-ms测定粗提物，采用chemstation柱，柱条件设定为柱箱温度150℃(4min)，升温程序为4℃/min，进样口温度 250℃和检测器口280℃。质谱分析谱峰，通过gc-ms测定初步推算化合物的组分，分子结构和分子量大小，为后期纯化分离提供必要的数据支持。
[0121]
将qx8粗提物的gc-ms检测结果与质子库对比后，发现该菌株的抗菌化合物主要为吡咯类化合物结构，如表3所示，文献显示吡咯因各种治疗用途而闻名，并已被用作抗生素，抗肿瘤药，抗真菌药，抗炎药和降低胆固醇的药物。吡咯还具有抑制hiv-1病毒，dna聚合酶和蛋白激酶活性的能力。吡咯及其衍生物吡咯可保护癫痫发作，并用作有效的抗惊厥药。但该化合物与库比对相似度在80％左右，推断该菌株抑菌化合物分子上还有新的功能基团，后续研究将分离和纯化该化合物，进行表征鉴定和抗菌化合物的分子结构解析。
[0122]
表3 gc-ms命中化合物结构
[0123][0124][0125]
4.2硅胶柱洗脱
[0126]
硅胶柱层析是根据硅胶对不同物质的吸附能力差异，将混合物各个组分分离的一种方法。硅胶对大极性物质具有更强的吸附能力，极性小的物质不易被硅胶吸附而更容易被洗脱。当采用溶剂洗脱时，在硅胶上发生一系列吸附
→
解吸
→
再吸附
→
再解吸的过程，极性较大的物质，在硅胶上移动的距离小，后出柱；极性小的组分，在硅胶上移动的距离大，先出柱，分离目的样品正是利用不同物质对硅胶的亲和力不同的原理将其分开的，硅胶柱层析的目前最常用的层析分离方法，广泛应用于医药、水质处理、微生物发酵等方面。实验室通常根据蛋白的等电点或查阅相关文献资料来选择合适的离子交换剂，本研究根据文献综述选取chcl3和甲醇作为洗脱剂。在优化的嗜热厌氧芽孢杆菌最佳发酵条件的基础上，收集抗菌活性物质。
[0127]
硅胶柱分离是目前混合物分离的常用方法，具体步骤如下：
[0128]
(1)采用湿法填柱干法上样，将硅胶和chcl3混合均匀，沿着层析柱缓慢加入使得硅胶在柱体里面沉淀均匀无气泡。使用chcl3为流动相多次冲洗柱体使硅胶沉淀均匀；
[0129]
(2)将乙酸乙酯蒸干后获得的粗提物溶于甲醇，弃不溶物，加入15g 50-100目硅胶
粉于获得的澄清液体，旋转蒸发成干粉装，将其均匀填在硅胶柱柱头；
[0130]
(3)流动相使用chcl3 甲醇为流动相配比梯度洗脱获得不同分级馏份，并测试抗菌活性。
[0131]
4.3反向c18硅胶柱洗脱
[0132]
c18反相柱，原理与疏水层析一样，样品会因为疏水相互作用而被吸附，当降低极性的时候这种作用力降低就被洗脱.整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程，具体步骤如下：
[0133]
(1)采用湿法填柱湿法上样，甲醇浸泡c18 24h使碳链完全展开，沿层析柱缓慢加入使得c18在柱体内沉淀均匀无气泡。以甲醇为流动相冲洗柱体多次，使硅胶沉淀均匀；
[0134]
(2)将正向硅胶获得的粗提物溶于少量洗脱液，弃不溶物，将获得的澄清液体均匀填在硅胶柱柱头；
[0135]
(3)使用水 甲醇为流动相，按配比梯度洗脱获得不同分级馏份，并测试抗菌活性。
[0136]
4.4tcl板验证
[0137]
实验菌验证各洗脱分级的抗菌活性，将有抗菌活性的分级进行硅胶板上样验证，以甲醇和chcl3为流动相，以碘单质显色tcl板，获得单点的分级证明该分级为纯化物。其中，如图5所示，图5(a)为粗提物纯化后重结晶后的图片，图5(b)为硅胶板碘显色验证图片。
[0138]
4.5傅里叶红外分析
[0139]
将纯化的抗菌活性物质溶于甲醇，并利用傅立叶变换红外光谱仪进行红外光谱扫描获得红外光谱图，用于化合物基团的特征分析。
[0140]
4.6高效液相色谱仪分析
[0141]
高效液相色谱仪相对于薄层色谱器检测灵敏度更高。由于活性物质为未知化合物，且发现该化合物前期分离产物对210nm紫色激光有强烈荧光反应，根据分离时采用了 c18进行分级，故在高效液相色谱分析中选用c18柱(c18 5μ)进行验证。使用高效液相色谱仪检测代谢物组分，将高效液相色谱流动相为20％甲醇流速1ml/min，紫外检测器波长为210nm。
[0142]
4.7gc-ms分析
[0143]
gc-ms常用于天然代谢产物的研究，一般适合于相对分子质量较小的物质，本研究用gc-ms分析qx8代谢物的成分。gc-ms的chemstation柱条件设定为柱箱温度150℃(4min)，升温程序为4℃/min，进样口温度250℃和检测器口280℃。gc-ms测试完毕分析气相色谱峰。
[0144]
4.8核磁共振分析
[0145]
将10mg/ml纯化的化合物溶解于氘代氯仿测试化合物的cnmr1h和c13谱，并分析谱峰。
[0146]
4.9结果
[0147]
将收集的粗提物溶解，用大孔吸附树脂吸附，用40％乙醇洗脱，冻干后经硅胶柱层析，以氯仿:甲醇6:4v/v为流动性，收集馏分旋转蒸发获得固体。使用碳18柱，从c18 柱收集的馏分(含40％甲醇)显示出抑菌活性(图5)。冷冻干燥后进行高效液相色谱仪检测，在保留时间为8.732分钟处显示最大洗脱峰(图6a)。进行gc-ms分析以鉴定生物活性分子结构，与nist库相比，根据分子量、保留时间和分子式，样品中存在一种主要化合物，谱图显示在16.9分钟出现一个主峰，峰面积对应于样品中存在的化合物的含量。质谱分析表明化合物
质量为210da，分子式为c11h18n2o2(图6c)，还对活性部分进行了hr-ms分析，结果显示在m/z 211.14338处有一个主要的光谱峰。因此，活性化合物的实验分子量确定为210.14338(图6d)，这对应于活性部分的理论质量。通过ftir光谱进一步研究了化合物的吸收峰。ftir光谱显示位于(图6b)3,400
–
3,140 cm
–
1特征峰对应于酰胺n
–
h基团，2,940cm
–
1对应于烷基c
–
h基团，在1,638cm
–
1 处的特征峰对应c
–
o酰胺和c＝o的伸缩分别在1450
–
1244cm-1处。核磁共振中 (图6e)h nmr(400mhz,cdcl3)谱显示信号在1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.28(s,1h), 对应仲酰胺质子，在4.03(dd,j＝9.7,3.9hz,1h)，2.42
–
2.30(m,1h)和0.96(d,j＝6.5hz, 3h)对应次甲基质子，在3.63
–
3.51(m,2h)，2.13
–
1.99(m,3h)，1.98
–
1.85(m,1h) 和1.86
–
1.72(m,2h),对应哌啶质子。13c nmr(101mhz,cdcl3)谱显示信号在δ170.33, 166.24,对应酰胺碳原子，δ58.99，δ53.40对应环己烷类脂肪族碳原子,δ45.51，δ23.30 δ24.66,δ22.75δ28.10,对应哌啶碳原子,δ38.57,δ21.22,对应于脂肪族碳原子。质谱数据可以看到测到分子离子峰为211.14338，与理论值为[m h ]＝211.14410相符合。化学式 c11h18n2o2，结合碳谱氢谱将和高分辨质谱将其鉴定为 3-isopropylhexahydro-4h-pyrido[1,2-a]pyrazine-1,4(6h)-dione,该分子有两个手性中心(星号)，可能有少量的非对应异构体。另外在核磁里看到有一些杂质峰的存在，特别是在碳谱里有许多伴随的小峰，该物质来源与微生物发酵，有较好的非对应选择性。经scifinder查询这是第一个由微生物合成的具有抗菌活性和抗qs活性的化合物。
[0148]
4.10热稳定性和杀灭时间测定
[0149]
冷冻干燥后获得的化合物在不同温度下处理。铜绿假单胞菌用作测试细菌，以验证纯化化合物的热稳定性。该化合物由嗜热菌发酵分离过得，分子内六元环稳定性好，化合物在60℃处理21小时后仍具有良好的抗菌活性，80℃处理21小时后抑菌圈仍可达 8mm，说明化合物qx8具有良好的热稳定性和良好的应用前景。
[0150]
通过测定cgt928对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度为17
±
0.072mg l-1，在杀菌时间测定中，随着mic浓度的增加，qx8的杀灭时间增加。铜绿假单胞菌在14小时内被完全杀死。当粗提物浓度为mic的4倍时，可在1小时内将铜绿假单胞菌完全杀死。cfu 减少了7个对数单位(图4b)。以上结果说明qx8具有快速杀菌作用，增加剂量时铜绿假单胞菌迅速死亡说明qx8粗提物具有较强的杀菌作用。
[0151]
实施例5
[0152]
本实施例用于说明qx8提取物对铜绿假单胞菌的影响
[0153]
5.1qx8提取物对细胞形态和膜通透性的影响
[0154]
将过夜培养的假单胞菌稀释至od600 nm＝1.0，并在lb肉汤中接种12小时。收集细菌稀释至od600 nm＝1.0。将1xmic浓度的qx8提取物加入培养孔中，以qx8提取物为阳性对照，加水孔为阴性对照，孵育30分钟，显微镜下观察细胞形态。用电导法评价qx8对细胞通透性的影响，收集菌液用pbs洗3次，稀释至od600 nm＝2。加入等体积的含1
ⅹ
mic、2
ⅹ
mic、3
ⅹ
mic浓度的qx8提取物的pbs溶液，对照组加入等体积的pbs，在20℃环境温度下0.15.30.60.120min测量电导率，所有实验一式三份，重复数次
[0155][0156]
5.2qx8提取物对铜绿假单胞菌细胞代谢的影响
[0157]
活化后的铜绿假单胞菌用tsa 1:300稀释，37℃培养12小时，然后在培养基中加入 qx8提取物使浓度达到1xmic，37℃培养3小时。收集细胞并用pbs洗涤3次以去除细胞表面的水和培养基。在分析天平上准确称取0.6g菌体，置于研钵中，加入1g灭菌石英砂和2ml磷酸盐缓冲液。将研钵置于冰上研磨匀浆，在预冷的离心机中以12000 rpm离心10分钟，收集上清液备用。
[0158]
取收集的上清液0.1ml，加考马斯亮蓝工作液5ml，再用蒸馏水定容至6ml。加 1ml蒸馏水、5ml考马斯亮蓝工作液作对照，分别测定od595nm吸光度值，计算各处 理后的可溶性蛋白含量：取待测溶液2ml和等量dns试剂，测定处理后的吸光度值， 根据标准曲线计算菌丝体中的还原糖含量。
[0159]
取1ml收集的上清液，加入2ml三氯乙酸(8％)，加入1ml2,4-二硝基苯肼溶液 (0.1％)，摇匀，最后加入5ml naoh溶液(1.5mol/l)，测定各吸光度值然后使用波长为540nm的处理溶液的540nm，根据标准曲线计算单位质量细菌的丙酮酸含量。
[0160]
5.3反群体感应和抗生物膜活动
[0161]
抗qs活性的检测以紫罗兰cv026 atcc31532为报告菌株，肉桂醛为阳性对照，甲醇为阴性对照，通过定量紫罗兰素产量和抑菌圈直径评估抗生物膜活性。使用不同浓度的细菌(qx8菌株)提取物(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mg/ml)进行抗生物膜形成试验，使用铜绿假单胞菌菌株将培养过夜的铜绿假单胞菌稀释到96孔中不同浓度 qx8粗提物平板，37℃培养24小时，结晶紫染色法检测生物膜形成情况。所有实验一式三份。结果如图7所示。
[0162]
由图7可以看出，qx8表现出抗群体感应和抗生物膜活性，同时抑制浮游生物的生长。具体的，紫色色杆菌cv026在含有酰基高丝氨酸内酯的培养基上生长。加入 0.2xmic纯化物后，可观察到白色和紫色区域。在白色区域，细菌正常生长但不变色，表明该化合物存在下中断紫色色杆菌cv026对酰基高丝氨酸内酯的响应(图7a)。结果与之前的qs抑制剂肉桂相比，1xmbc显示出显着的抑菌率，使用提取溶剂甲醇作为阴性对照未检测到抑菌圈(图7b)。紫胶素产量与qs的活性呈正相关。因此，使用不同浓度的qx8提取物来评估qsi的水平。研究发现，提取物对紫胶素抑制率呈剂量依赖性。随着提取物浓度的增加，紫胶素含量下降，0.7x mic的紫胶素含量下降了94％(图 7c)。以上结果表明，qx928的纯化产物可以通过抑制细菌对信号因子酰基高丝氨酸内酯的反应来中断细胞间的群体感应。
[0163]
5.4生物膜形成分析
[0164]
铜绿假单胞菌在具有不同浓度qx8提取物的24孔聚苯乙烯板中生长，以评估无菌玻璃盖玻片(11毫米)上生物膜的发展。在24孔聚苯乙烯板中，将1ml含有od600 nm＝0.1的铜绿假单胞菌培养物的lb培养基添加到每个孔中，并具有不同密度的 qx8提取物。将一张玻璃盖玻片浸没，37℃静置培养板，同时另一组铜绿假单胞菌培养 24小时形成正常膜时，取一定16mg/l的qx8粗提物加入培养液孵育3小时，然后用荧光染料染色生物膜。生物膜内的细菌细胞用荧光染料(碘化丙啶和荧光素二乙酸酯)标记，根据制造商的说明进行进一步处理，并在落射荧光显微镜下观察。活细胞为绿色，死细胞为红色。评估qx8粗提物对成膜的影响，实验中以等体积甲醇作为阴性对照。
[0165]
图8显示了荧光显微镜下化合物对铜绿假单胞菌生物膜结构的影响。由图8可以看出qx928用于评估生物膜的抑制和杀伤活性。铜绿假单胞菌用碘化丙啶和草酸荧光素标记。在激光共聚焦荧光显微镜下观察，死细胞呈红色，活细胞呈绿色荧光。实验组用 0.5
×
mic
处理24小时(图a，试验b)。与对照组相比，用qx8粗提物处理的生物膜结构松散，发育缺陷，细胞连接不紧密。正常发育的对照组具有完整的膜结构。对照组和实验组之间存在显着差异。实验组微生物死亡数远高于对照组。
[0166]
当膜结构发育正常时，与实验组相比，加入1x mic qx8粗提液，膜结构被破坏，发生穿孔撕裂。大量细胞死亡。对照组结构正常，细胞间连接紧密。结果表明，qx8粗提物在低浓度下对铜绿假单胞菌的生长有抑制作用，在高浓度下可有效杀灭参比菌，破坏已形成的生物膜。
[0167]
5.5扫描电子和原子力显微镜
[0168]
使用扫描电子显微镜(sem)和原子力显微镜(afm)观察qx8提取物对铜绿假单胞菌形成的生物膜拓扑结构的影响。对于sem而言，铜绿假单胞菌的生物膜生长在浸入bhi 的盖玻片上。24孔聚苯乙烯板上的肉汤。将培养板和盖玻片在37℃下放置24小时。加入不同浓度(12mg/l和18mg/l)的cgt 928提取物，37℃孵育6小时去除浮游生物，用0.9％pbs轻轻冲洗盖玻片。样品用2.5％戊二醛处理20分钟，用乙醇梯度(10％至95％) 脱水10分钟。脱水和干燥的生物膜用金覆盖并在扫描电子显微镜下观察。
[0169]
对于afm，将在bhi肉汤中过夜生长的铜绿假单胞菌稀释至od600 nm＝0.1，将无菌盖玻片浸入24孔聚苯乙烯板中，并将板保持在37℃下24小时。将不同浓度的qx8添加到培养基中并孵育6小时。在此潜伏期后，用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)轻轻冲洗盖玻片上形成的生物膜，然后将其置于干燥器下直至完全干燥。最后，在afm下以半接触模式扫描生物膜。实验中用等体积的甲醇作为阴性对照。
[0170]
由图9可以看出，qx8提取物破坏了生物膜的拓扑结构。具体的，在sem和afm 下，我们可以看到qx8粗提物对铜绿假单胞菌形成的生物膜拓扑结构的影响。与对照组相比，扫描电镜在粗提物存在下观察到散在的细胞和未成熟的细胞膜。在afm下也观察到膜的结构、表面形貌变化，表面不平整，生物膜对玻璃板表面的附着力较差。高度分布表明正常膜结构平坦，结构紧密。实验组膜结构有穿孔。膜厚显着降低qx8提取物下调铜绿假单胞菌的运动能力。
[0171]
5.6蜂群运动性测定和游泳运动性测定
[0172]
在qx8提取物存在(1.0mg/ml)的情况下测试蜂拥运动。将过夜生长的铜绿假单胞菌稀释至od600 nm＝1.0并点在含有bm2蜂群培养基(ph 7的62mm pbs、2mmmgso4、10μm feso4、0.4％葡萄糖、0.1％酪蛋白氨基酸和0.5％琼脂)补充10.0mg/lsj16提取物补充剂。将平板在37℃下孵育24小时并观察蜂群区。实验中以等体积甲醇作为阴性对照。
[0173]
将过夜的铜绿假单胞菌稀释至od600 nm＝1.0，在补充有12.0mg/l qx8提取物(10 g/l胰蛋白酶、5g/l nacl和0.3％琼脂)的胰蛋白酶肉汤中点样，37℃孵育平板24小时进行分析。实验中以等体积甲醇作为阴性对照。
[0174]
5.7毒力因子分析
[0175]
通过测量绿脓素和鼠李糖脂的水平，以及分析弹性蛋白酶和蛋白酶活性，研究了 qx8细菌提取物(12.0mg/l)对参考铜绿假单胞菌毒力因子产生的影响。对于绿脓素测定，铜绿假单胞菌菌株经过过夜培养并在pb培养基(5ml；20g/l蛋白胨、1.4g/l mgcl2 和10g/l k2so4)中稀释至od600nm＝0.1。试管灭菌，加入10ml pb培养基，补充 qx8粗提液，37℃孵育24小时。对照组加入等体积甲醇作为阴性对照。收集含有5ml pb 培养基(od600nm＝0.1)的
上清液，10,000
×
g离心10min；绿脓素在3ml氯仿中提取，然后加1ml 0.2n hcl，并在520nm分光光度计定量。对于鼠李糖脂测定，铜绿假单胞菌菌株(od600nm＝0.1)在nb培养基中于37℃下生长过夜，并补充有对照组添加10mg/l qx8提取物提取物并加入等体积甲醇作为阴性对照。将培养物离心(10,000
ꢀ×
g 10min)，收集上清液并酸化至ph 2(用hcl)，在570nm处测量吸光度。
[0176]
qx8提取物对毒力因子具有抑制作用
[0177]
铜绿假单胞菌的毒力活性主要包括弹性蛋白酶和蛋白酶活性，毒力因子的形成加速了生物膜的形成。qx8处理后，铜绿假单胞菌的毒力因子显着降低。与对照组相比， qx8存在下绿脓素降低了14.7％；鼠李糖脂含量下降58.2％。对活性的活性表现出强烈的抑制作用。与对照组相比，弹性蛋白酶活性下降34.3％，蛋白酶活性下降87.1％。以上结果表明，qx8粗提物强烈抑制细胞间信号通道，抑制生物膜的形成。
[0178]
5.8弹性蛋白酶测定
[0179]
为了评估弹性蛋白酶的活性，将含有qx8提纯物的铜绿假单胞菌培养过夜，并将培养物的上清液(750μl)和弹性蛋白刚果溶液(250μl；5mg/in 0.1m tris-hcl ph 8；1 mm cacl2)ml)37℃孵育16h，对照组加入等体积甲醇作为阴性对照，离心反应混合物 (3,000
×
g，10分钟)，收集上清液，在495nm测定吸光度，对照组加入等体积的甲醇作为阴性对照，实验平行3次。
[0180]
5.9qx8提取物对细胞代谢具有抑制作用
[0181]
对于铜绿假单胞菌的代谢作用，我们主要测定了丙酮酸、可溶性蛋白和还原糖的含量。丙酮酸是参与生物的基本产物之一。丙酮酸含量的变化从侧面反映了提取物对细菌代谢的影响。经qx8处理后，丙酮酸含量较对照组下降16.9％；还原糖含量较对照组降低31％；与对照组相比，实验组的可溶性蛋白受到显着影响相比之下减少了41.5％。 qx8粗提物可能会影响可溶性蛋白的合成或破坏细胞膜，导致蛋白丢失和可溶性蛋白减少。以上结果表明qx8粗提物对细胞代谢有强烈抑制作用，抑制生物膜的形成和细胞生长。
[0182]
5.10qx8提取物对细胞膜离子通透性的影响
[0183]
细胞被细胞膜包裹着，当细胞膜受损时，其通透性会发生变化。原生质会泄漏并渗透到液体中会导致溶液导电率上升增加电导率。与对照组相比加入qx8化合物后，水的电导率随着时间的推移而出现上升，其溶液的导电率和化合物成剂量依耐，而对照组导电率基本保持不变。结果如图10所示，表明，粗提物破坏了细胞膜并改变了其通透性。
[0184]
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0185]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0186]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。