一种人糜蛋白酶原及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物酶技术领域，具体涉及一种人糜蛋白酶原及其制备方法和应用。


背景技术：

2.糜蛋白酶(ec3.4.21.1)，又称胰凝乳蛋白酶，属于丝氨酸蛋白酶家族，在生物体内以酶原形式产生，经胰蛋白酶和自身水解作用形成具有活性的糜蛋白酶，主要水解侧链为大型疏水性氨基酸残基的羧基端肽链，如tyr、trp、phe和leu等。
3.糜蛋白酶在临床上应用非常广泛，主要用于外科的手术或外伤后的炎症、炎性水肿、血肿、粘连、溃疡等；胸科的脓胸、血胸、术后咳痰困难，肺不胀等；内科的慢性支气管炎、支气管哮喘等；妇产科的宫颈炎、输卵管炎、盆腔炎等；眼科及五官科的角膜炎、化脓性中耳炎等疾病的治疗。
4.目前糜蛋白酶主要从猪、牛的胰脏中提取，因其动物源性，存在未知病毒和外源因子污染的风险，在制药行业的应用受到很大的限制。另外由于胰蛋白酶和糜蛋白酶结构与性质相似，通过原材料的提取分离纯化不能得到完全单一的糜蛋白酶，甚至很难得到高纯度的糜蛋白酶。通过重组工程菌表达人糜蛋白酶原，可以生产高纯度的人糜蛋白酶原，酶原经激活即可得到人糜蛋白酶。用无动物源性的重组人糜蛋白酶替代从动物胰腺提取的糜蛋白酶符合生物药物的发展趋势，本领域需要大规模生产人源的糜蛋白酶。
5.然而重组人糜蛋白酶原的表达量低是限制其大规模生产和应用的关键因素，目前可见报道的重组人糜蛋白酶原的产量不到0.5g/l(simon curvers等人，biotechnol.prog.2001,17,495-502)。因此本领域急需提高重组人糜蛋白酶原产量的方法。


技术实现要素：

6.为解决现有技术中人糜蛋白酶原表达量低的问题，本发明提供了一种重组的人糜蛋白酶原及其制备方法和应用。本发明在对人糜蛋白酶原氨基酸序列进行密码子优化并表达时，意外得到一种可高产重组人糜蛋白酶原的核苷酸序列。采用该序列能够在大肠杆菌或毕赤酵母中可溶性表达重组人糜蛋白酶原，表达量可高达2g/l，高于已有报道重组人糜蛋白酶原最高表达量的4倍。同时采用该序列发酵所得酶原制备得到的人糜蛋白酶具有高效的降解蛋白的活性。
7.本发明采用技术方案如下：
8.本发明提供了一种人糜蛋白酶原，所述人糜蛋白酶原包含如seq id no.1所示的氨基酸序列；
9.优选地，编码所述人糜蛋白酶原的核酸包含如seq id no:2所示的核苷酸序列；
10.更优选地，编码所述人糜蛋白酶原的核酸包含如seq id no:3所示的核苷酸序列；
11.或，编码所述人糜蛋白酶原的核酸包含如seq id no:4所示的核苷酸序列。
12.本发明提供了一种人糜蛋白酶，其特征在于为利用如上所述的人糜蛋白酶原制备
得到。所述人糜蛋白酶的3条链的氨基酸序列分别如seq id no:12-14所示。
13.本发明提供了一种分离的核酸，所述核酸包含如seq id no:2、3或4所示的核苷酸序列。
14.本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如上所述的分离的核酸。
15.优选地，所述重组载体中包含的启动子的核苷酸序列如seq id no:5或seq id no:6所示，所述重组载体中包含的信号肽的核苷酸序列为编码氨基酸序列如seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9所示的核苷酸序列。
16.本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌包含如上所述的核酸或如上所述的重组表达载体；
17.优选地，所述基因工程菌采用的宿主菌为大肠杆菌或毕赤酵母；更优选地，所述的宿主菌为毕赤酵母；进一步更优选地，所述的宿主菌为毕赤酵母gs115。
18.本发明提供了一种制备所述的人糜蛋白酶原的方法，所述方法包括如下步骤：将如上所述的基因工程菌进行发酵培养，诱导所述人糜蛋白酶原表达，即得；
19.其中，所述的发酵培养的培养温度为20-37℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。更优选地，所述的发酵培养的培养温度为25-30℃。
20.其中，所述发酵培养的溶氧量为0-50％，例如可以是0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。
21.其中，所述发酵培养的ph为3.0-7.0，例如可以是3.0、4.0、5.0、6.0或7.0。
22.其中，所述发酵培养中通过底物限制流加及好氧深层发酵培养12-72小时(以下均采用h表示小时)，例如可以是12h、13h、14h、15h、18h、20h、22h、25h、26h、28h、30h、35h、38h、40h、42h、45h、48h、50h、55h、58h、60h、62h、65h、68h、70h或72h。
23.其中，所述诱导使用的诱导剂为iptg或甲醇，和/或，所述诱导使用的诱导剂加入的时间为发酵培养开始后24-120h。
24.其中，所述发酵培养中诱导剂加入后的培养时间为6-120h。例如可以是6h、12h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h、72h、78h、84h、90h、96h、102h、108h、114h或120h。
25.其中，所述重组表达菌株经过验证正确后，进行扩大工业化生产糜蛋白酶。
26.本发明还提供了一种制备人糜蛋白酶的方法，所述方法包括：激活如第一方面所述的人糜蛋白酶原，激活方法例如胰蛋白酶与糜蛋白酶纯品蛋白按照1:10000的比例混合，ph 7.8的条件下，2-8℃激活24h。
27.本发明提供了一种降解蛋白的方法，其特征在于，将如上所述的人糜蛋白酶与靶蛋白接触，使靶蛋白降解。
28.本发明提供了如上所述的人糜蛋白酶原或人糜蛋白酶在制备治疗疾病药物中的应用；
29.较佳地，所述疾病选自浓痰、不孕不育、粘连、糖尿病足或烧烫伤引起的腐烂、脓肿血肿、炎症、体表囊肿和腱鞘囊肿疾病、蛇毒、外伤创口、手术伤口、泪道阻塞、口腔疾病、眼科疾病等；更佳地，在治疗眼科疾病时还可用于眼科手术以松弛睫状韧带。
30.其中，所述浓痰由呼吸道中炎症病变或者其他因素引起，是由粘液、异物、病原微
生物、各种炎症细胞及坏死脱落的粘膜上皮细胞等成分组成痰液。
31.其中，所述不孕不育具体包括输卵管性不孕、精子液化异常等。
32.其中，所述粘连包括但不限于术后肠粘连、肌腱粘连、术后盆腹腔粘连、术后肠粘连等。
33.其中，所述糖尿病足为糖尿病足溃疡(dfu)，糖尿病足溃疡首先通过伤口清创术去除腐肉、坏死组织并控制感染后，再进行内外科的综合治疗，加速伤口愈合，修复创面。
34.其中，所述脓肿血肿包括但不限于牙周脓肿、乳腺脓肿、肛周脓肿、小儿脓胸、腱鞘囊肿、颅脑血肿等。
35.其中，所述炎症包括但不限于创伤性虹膜睫状体炎、中耳炎、鼻炎、鼻窦炎、咽喉炎、扁桃体炎、虹膜睫状体炎、上下呼吸道感染、支气管炎、肺炎、慢性阻塞性肺疾病(copd)、哮喘、盆腔炎、膝关节炎、肩周炎、慢性泪囊炎、急性耳咽管阻塞、慢性咽炎声带息肉、疱疹性口炎、根尖周炎、溃疡性结肠炎、骨关节结核合并脓肿、胃石症等。
36.其中，所述体表囊肿和腱鞘囊肿疾病为腱鞘囊肿、囊肿性痤疮、皮脂腺囊肿、表皮样囊肿、皮样囊肿等。
37.其中，所述外伤创口包括各种外伤、溃疡、褥疮等。
38.其中，所述术后伤口包括肛肠疾病手术、刨宫产手术、肛肠疾病手术、声带小结手术、气管切开手术、鼻内镜鼻窦手术等造成的手术窗口。
39.本发明提供了如第一方面或第二方面所述的糜蛋白酶在制备器械清洗的试剂中的应用，所述器械包括但不限于胃镜、肠镜、气管套管、手术器械、生化或血液检测仪器等。
40.除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
41.术语“核酸”或者“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(batzer等人,nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和cassol等人,(1992)；rossolini等人,mol cell.probes8:91-98(1994))。
42.术语“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
43.术语“宿主菌”意指包含本发明核苷酸的菌，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主菌，例如直接摄取、转导、配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主菌可为原核菌或真核菌。
44.术语“转化”意指将异源性dna序列引入到宿主菌或有机体的方法。
45.术语“表达”意指内源性基因或转基因在菌中的转录和/或翻译。
46.本发明的积极进步效果在于：
47.采用本发明提供的人糜蛋白酶原编码核苷酸序列，能够在大肠杆菌或毕赤酵母中可溶性表达重组人糜蛋白酶原，表达量可高达2g/l，高于已有报道重组人糜蛋白酶原最高表达量的4倍。同时采用该序列发酵所得酶原制备得到的人糜蛋白酶具有高效的降解蛋白的活性。
附图说明
48.图1为3种重组人糜蛋白酶原表达载体图谱；
49.图2为重组人糜蛋白酶原表达克隆表达产物的电泳结果；
50.图3为重组人糜蛋白酶原表达菌株50l发酵罐发酵不同诱导时间表达产物的电泳结果。
具体实施方式
51.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
52.实施例1：重组人糜蛋白酶原表达菌株构建
53.通过对天然人糜蛋白酶原氨基酸序列针对毕赤酵母表达系统进行密码子优化后获得3种不同的人糜蛋白酶原核苷酸序列，3种序列如表1所示。
54.表1.3种不同密码子优化的人糜蛋白酶原核苷酸序列
55.序列名称seq id no:hctrb110hctrb22hctrb311
56.将3种人糜蛋白酶原核苷酸序列3’端添加终止密码子tga后分别通过重组的方式替换ppic9k载体中从snabi酶切位点到avrii酶切位点的一段18个碱基的序列，从而将人糜蛋白酶原核苷酸序列重组至ppic9k表达载体中，构建成3种重组人糜蛋白酶原表达载体，载体图谱如图1的a～c所示。
57.将3种重组人糜蛋白酶原表达载体分别转化到毕赤酵母gs115中，通过md平板筛选得到含有人糜蛋白酶原核苷酸序列的阳性重组表达菌株。
58.具体地，3种核苷酸序列的表达菌株各挑取2个单克隆接入5ml bmgy中于24孔深孔板中，28℃培养24h至od
600nm
达到10～20，取出一定菌液离心后菌体沉淀用500ul bmmy重悬至od
600nm
达到100。再转入24孔深孔板中，28℃培养6～8h后，加入甲醇至终浓度为4％，继续培养16～18h。收集上清进行sds-page电泳检测。
59.电泳结果如图2所示，3种核苷酸序列中hctrb2表达量显著高于其他2种序列，且hctrb2的2个克隆表达量差别不大，选择hctrb2-克隆1作为重组人糜蛋白酶原表达菌株进
行扩大发酵培养。
60.实施例2：重组人糜蛋白酶原的扩大发酵培养
61.实施例1确定的重组人糜蛋白酶原表达菌株经摇瓶培养逐步扩大到50l发酵罐规模的发酵生产。以bsm培养基作为发酵培养基，以补料流加和深层通气培养方式发酵培养，选择甘油作为诱导前限制性碳源控制流加，选择甲醇作为诱导剂及诱导后限制性碳源控制流加。发酵温度30℃，通过补加25％氨水控制ph6.0。发酵罐通气量选择为0.5-2.0vvm，通过控制补料速率、搅拌速率和通气量实现溶氧值在30％左右。在发酵培养过程中，定期取样，测定菌体湿重，当菌体湿重达到一定值后，开始流加甲醇进行诱导。诱导培养96小时后结束发酵，离心分离并收集上清。通过sds-page电泳检测表达量。电泳结果如图3所示。取2l上清样品通过纯化后获得4.08g人糜蛋白酶原纯品蛋白，由此，上清中人糜蛋白酶原的表达量不低于2.04g/l，此表达量是已有报道重组人糜蛋白酶原表达量(0.5g/l)的4倍。
62.实施例3：重组人糜蛋白酶的活性检测
63.采用胰蛋白酶对实施例3获得的人糜蛋白酶原纯品蛋白进行催化激活。胰蛋白酶与人糜蛋白酶原纯品蛋白按照1:10000的比例混合，ph 7.8的条件下，2～8℃激活24h。激活后的人糜蛋白酶按照《中国药典》2020版糜蛋白酶效价测定方法进行活性检测。检测结果上述制备的人糜蛋白酶比活可高达1446u/mg，高于药典要求“每mg效价不得少于800单位”。
64.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。