一株纺锤链霉菌LS159及其应用

一株纺锤链霉菌ls159及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及微生物菌种及其在植物病害生物防治领域和食品防腐保鲜领域的应用，更具体涉及一株纺锤链霉菌及其应用。


背景技术：

2.微生物在自然界中普遍而广泛存在，它们其中的大部分是对人类无害或者是有益的，既可以应用活菌细胞进行食品发酵、疫苗开发，又可以利用其生理代谢作用进行有机酸、酶制剂、抗生素代谢产物的生产等，并且在自然界物质循环及资源化利用中发挥重要作用。但也有一小部分的微生物可以引起植物病害，造成食品腐败变质，给人类造成危害和损失。对于引起植物病害和食品腐败变质的有害微生物，一直以来以化学农药和化学防腐剂的应用主要措施。随着人们生活水平的提高，对食品安全和生态环境保护意识逐步提升，对绿色、低毒害的防治措施的应用需求不断增加。
3.放线菌作为一类革兰氏阳性原核微生物，在土壤、水体、植物表面及内部等环境广泛存在，并且很多种类可以产生抗菌性能，是植物病害防治及食品防腐保鲜中较常使用的种类。研究表明，某些放线菌通过产生抗生素、几丁质酶抑制有害微生物生长，或者通过生态位、营养竞争限制和阻止病原菌生长，从而减轻病害侵染和危害。放线菌中研究和应用最多的是链霉菌（streptomyces spp.），如细黄链霉菌（s. microflavus）、卡那霉素链霉菌（s. kanamyceticus）、龟裂链霉菌（s. rimosus）、球孢链霉菌（s. globisporus）等，但是关于纺锤链霉菌（s. netropsis）在有害微生物防控及相关性质方面的报道较少。中国专利（公开号：cn107058131a）公开了一株防治小麦赤霉病、降低小麦中赤霉素含量的纺锤链霉菌，该菌是从水稻地采集的土壤中分离筛选获得。大量研究表明，同一种微生物不同菌株生物学特性及对不同病害的拮抗效果存在较大差别，因此需要继续筛选更多能够防治其他病害的菌株，为该菌的应用提供更丰富的菌种资源。
4.微生物菌剂的发酵需要添加适合和碳、氮源等营养物质，为了降低成本在选择培养基质时往往考虑使用一些工农业生产后的废弃物，这些废弃物中含有一定量的碳源、氮源等物质，经过适当调整可用于菌剂发酵的优良培养基来源。其中啤酒生产过程经历糖化、发酵、灌装等工序产生大量废水，这些啤酒废水中含有糖类、蛋白质等丰富有机物。我国是啤酒生产和消费大国，每生产 1吨啤酒会产生 3-10吨的废水，啤酒废水排放量大，啤酒厂每年因处理啤酒废水需要花费大量资金，消耗大量能源。从另一个角度考虑，啤酒废水中的有机质（包括：糖类、蛋白质等）是微生物生长的良好营养底物，可以做成微生物培养基，发酵生产微生物产品。


技术实现要素：

5.基于此，本发明专利在筛选具有抑制植物病原微生物和食品腐败微生物的纺锤链霉菌的同时，对其进行生理特性和分子鉴定，并利用啤酒废水对纺锤链霉菌发酵培养，这将对于减少化学药剂的使入、降低环境污染、提高食品安全，以及实现农业可持续发展具有重
要意义。本发明人最终筛选和鉴定获得一株纺锤链霉菌（streptomycesnetropsis）ls159，并对其功能进行了深入研究，由此完成本发明。
6.本发明首先提供一种株纺锤链霉菌（streptomycesnetropsis）ls159菌株，其保藏编号为cgmcc no.19503。
7.研究结果表明，ls159菌株对板栗疫病病原菌（cryphonectria parasitica)、杨树立枯丝核菌（rhizoctonia solani）、胡萝卜软腐病原菌（pectobacterium carotovorum）和番茄青枯病原菌（ralstonia solanacearum）具有较强的抑制作用；此外对大白菜根腐病病原菌（fusarium oxysporum）和细菌性杨树溃疡病原菌（botryosphaeria dothidea）也具有一定的抑制作用。而且比同一种纺锤链霉菌（菌株编号ls286）对这8种病原菌的抗菌谱及抗菌效果更好。与同一地区分离到的其他链霉菌相比，抑菌谱和抑菌效果也有所不同。因此，本发明进而提供所述ls159菌株作为生防菌的应用。更具体地，其用于防治板栗疫病病原菌（cryphonectria parasitica)、杨树立枯丝核菌（rhizoctonia solani）、胡萝卜软腐病原菌（pectobacterium carotovorum）或番茄青枯病原菌（ralstonia solanacearum）导致的真菌性病害；或者用于大白菜根腐病病原菌（fusarium oxysporum）、细菌性杨树溃疡病原菌（botryosphaeria dothidea）导致的细菌性病害。更具体地，其用于板栗、杨树、胡萝卜、番茄或大白菜的病害防治。
8.进一步研究表明， ls159菌株对8种常见引起食品腐败的真菌和细菌均有拮抗作用，其中对扩展青霉（penicillium expansum)、金黄葡萄球菌( staphylococcus aureus) 和大肠杆菌（escherichia coli）的拮抗效果最好，对黄曲霉（aspergillusflavus）、链格孢菌（alternaria alternata）和蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）也有较好的抑制效果。故本发明进一步提供所述ls159菌株在防治食品腐败中的应用。更具体，其用于抑制黑曲霉（aspergillus niger）、黄曲霉（aspergillusflavus）、扩展青霉（penicillium expansum)）、链格孢菌（alternaria alternata），或者金黄色葡萄球菌( staphylococcus aureus)、大肠杆菌（escherichia coli）、蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）、凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）。
9.本发明进一步研究表明，所述ls159菌株能够较好地利用啤酒废水为主要成分的培养基，与isp2培养基相比，在培养初期的1-3d，利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌生长速度慢于isp2培养基发酵的处理，但在发酵中后期二者生长量逐渐接近一致。因此，本发明还提供一种利用啤酒废水发酵所述ls159菌株的方法。具体地，其以啤酒废水为基本成分的发酵培养液对所述ls159菌株进行发酵。更具体地，所述发酵培养液是将啤酒废水与自来水按体积比为1：3-8混合，然后添加葡萄糖、酵母浸粉，调节ph至7.0-7.4，灭菌冷却即可。所述发酵条件为30-34 ℃、100-200 rpm培养3-7d。优选地，所述发酵培养液是将啤酒废水与自来水按体积比为1：5混合，然后添加0.5%的葡萄糖、0.5%的酵母浸粉，调节ph7.2，灭菌冷却即可；培养条件为32 ℃、150 rpm培养5d。
10.而且研究表明，利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌ls159 菌液的抑菌功能与在isp2培养基上培养的菌液效果一致，说明可以利用啤酒废水发酵拮抗菌纺锤链霉菌。因而本发明还提供上述发酵方法获得的菌液。并更进一步地，本发明提供所述菌液在作为生防菌的应用或在防治食品腐败中的应用。
11.本发明筛选获得的ls159菌株具广谱的抗菌性，既可用于生防菌，也可用于防止食
品腐败，具有广泛的应用价值。
附图说明
12.图1拮抗放线菌不同菌株对茄腐皮镰刀菌fd1的抑菌作用。
13.图2ls159菌株16s rdna系统发育树。
14.图3利用啤酒废水发酵纺锤链霉菌ls159效果。
15.生物材料保藏信息： 本发明的ls159菌株命名为纺锤链霉菌（streptomycesnetropsis），于2020年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），其简称为 cgmcc，保藏编号为cgmcc no. 19503。
具体实施方式
16.下面通过具体实施例对本发明进行阐述，以期列好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。
17.实施例1 具有拮抗功能的链霉菌的分离筛选（1）土壤样品来源土壤取自山西长治市襄垣县油用牡丹种植基地，选取生长健康的5年生油用牡丹植株，将植株连根拔起，轻轻抖落后用无菌毛刷刷取粘在根部的土壤（即根际土），每5棵植株的样品混为一个土样，将土壤装入无菌塑封袋，带回实验室于4℃冰箱中保存。
18.（2）链霉菌菌株的分离取10 g 根际土壤样品放于90 ml的无菌蒸馏水中，均匀振荡30 min后，土壤悬液分别稀释至10-3
，10-4
，10-5
倍。取100 μl 稀释液涂布于高氏i号固体培养基上（高氏i号合成培养基37.5 g，3%重铬酸钾（aq）3ml，蒸馏水1000 ml，ph 7.4-7.7）。倒置培养于30℃ 恒温培养箱，3-7d后观察平板，挑选形态，色泽，大小不同的菌落于高氏i号培养基平板上划线，将纯化后的菌株保存于4℃冰箱，供下一步拮抗菌的筛选。
19.（3）菌株拮抗功能筛选采用平板对峙培养法，对上述分离菌株进行拮抗效果的筛选。病原菌采用实验室保存的对油用牡丹有强致病性的茄腐皮镰刀菌（fusariumsolani）fd1，在改良pda培养基（即pda培养基与isp2培养基1:1比例混合：酵母浸粉 2 g，麦芽浸粉 5 g，葡萄糖 2 g，nacl 5 g，酵母浸粉 2.5 g，蛋白胨 5 g，蒸馏水1000 ml）平板中央，将活化好的茄腐皮镰刀菌fd1用灭菌打孔器取直径为0.5 cm的圆形病原菌块放在平板中心，将待检测放线菌点接在距离病原菌块2.5 cm处，每个平板接3种放线菌，28 ℃培养箱中培养5-7 d，每天观察并记录放线菌对病原菌的抑制情况，用游标卡尺测定测量病原菌直径和拮抗半径，计算抑菌率。抑菌率=（对照病原菌直径-处理病原菌直径）/对照病原菌直径*100%。
20.结果表明，在山西省长治地区油用牡丹田间采集的油用牡丹根际土壤中共分离到650株纯种微生物，根据菌落形态判断，放线菌共有42株。其中对茄腐皮镰刀菌fd1有拮抗作用的放线菌20株，抑菌率大于50%的菌株有5株，分别为ls2、ls62、ls159、ls164和ls286，其中抑菌率最高的菌株为ls159和ls164，具体见图1。
21.实施例2 链霉菌ls159的理化特征及16s rrna 分子鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》对拮抗茄腐皮镰刀菌效果最好的菌株ls159进行形态学观察和生理生化鉴定，同时将该菌株进行16srrna基因扩增和测序分析。
22.菌株ls59理化特征结果如下：在isp2固体培养基上（酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，琼脂20g，蒸馏水1l，ph7.4-7.6）该菌株基内菌丝浅黄色，气生菌丝浅褐色，不透明，孢子长柱状，表面光滑。培养48h后出现皱褶，培养3-7天产生孢子，革兰氏染色阳性，能够利用淀粉，产生过氧化化氢酶，v.p.测定为阳性（见表1）。
23.表1ls159菌株形态特征及生理生化测定结果注：“ ”表示结果为阳性，
“‑”
表示结果为阴性。
24.16srrna基因测序后在ncbi上进行blast比对分析，结果表明该菌与纺锤链霉菌streptomycesnetropsis（nr112494.1）同源性最高达99.86%，与其他链霉菌相距较远。基于以上特征，将ls159菌株命名为纺锤链霉菌（streptomycesnetropsis），构建系统发育树结果见图2，该菌于2020年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为cgmcc（单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏编号为cgmccno.19503。
25.实施例3纺锤链霉菌ls159对多种植物病原微生物的拮抗作用选择发病较普遍的植物真菌病害和细菌病害的病原微生物各4种为实验材料，采用平板对峙法对纺锤链霉菌ls159的拮抗功能谱进行测定，同时以分离获得的另外4株对茄腐皮镰刀菌fd1抑菌率高的链霉菌作对比。4种病原真菌为辣椒疫霉病病原菌（phytophthoracapsici）、板栗疫病病原菌（cryphonectriaparasitica)、杨树立枯丝核菌（rhizoctoniasolani）、大白菜根腐病病原菌（fusariumoxysporum），4种病原细菌为番茄细菌性斑点病原菌（pseudomonassyringae）、胡萝卜软腐病原菌（pectobacteriumcarotovorum）、番茄青枯病原菌（ralstoniasolanacearum）、细菌性杨树溃疡（botryosphaeriadothidea）。
26.取链霉菌单菌落接种在isp2液体培养基中，30℃、150rpm培养3-5d，培养好的菌液用于平板对峙实验。对于病原真菌拮抗作用，进行平板对峙实验时在改良pda培养基（即pda培养基与isp2培养基1:1比例混合：pda培养基为200g去皮马铃薯切成小块后，放于蒸馏水中煮，待水开后用8层纱布过滤并用蒸馏水补充至1l，加入20g葡萄糖，加16g琼脂粉；isp2培养基为酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，水1l）平板中心接种已活化的0.5cm
×
0.5cm的病原菌菌块，在距离病原菌2.5cm的两侧对称打孔，每孔加入100μl的链霉菌菌液，每个处理重复3次，在28℃培养箱中培养5-7d，用游标卡尺测定测量对病原菌的拮抗半径。对于病原细菌拮抗作用，进行平板对峙实验时，取培养好的4种病原细菌各200μl分别涂布在lb改良培养基（即lb培养基与isp2培养基1:1比例混合：lb培养基为nacl10g，酵母浸粉5g，蛋白胨10g，蒸馏水1l，ph7.0-7.5；isp2培养基为酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，水1l）平板上，在平板中间打3个直径为0.7cm孔，孔中加入100μl链霉菌菌液，在30℃培养24-36h，用游标卡尺测定抑菌直径。
27.结果表明，ls159对板栗疫病病原菌（cryphonectria parasitica)、杨树立枯丝核菌（rhizoctonia solani）、胡萝卜软腐病原菌（pectobacterium carotovorum）和番茄青枯病原菌（ralstonia solanacearum）具有较强的抑制作用；此外对大白菜根腐病病原菌（fusarium oxysporum）和细菌性杨树溃疡病原菌（botryosphaeria dothidea）也具有一定的抑制作用。而且比同一种纺锤链霉菌（菌株编号ls286）对这8种病原菌的抗菌谱及抗菌效果要好。与同一地区分离到的其他链霉菌相比，抑菌谱和抑菌效果也有不同。具体结果见表2。
28.表2不同链霉菌对8种植物病原微生物的抑菌作用注：病原真菌1.辣椒疫霉病病原菌（phytophthora capsici）；2.板栗疫病病原菌（cryphonectria parasitica)；3.杨树立枯丝核菌（rhizoctonia solani）；4.大白菜根腐病病原菌（fusarium oxysporum）。病原细菌：1.番茄细菌性斑点病原菌（pseudomonas syringae）；2.胡萝卜软腐病原菌（pectobacterium carotovorum）；3.番茄青枯病原菌（ralstonia solanacearum）；4.细菌性杨树溃疡（botryosphaeria dothidea）。
“‑”
无拮抗；“ ”0《拮抗半径《5mm；“
”ꢀ
5《拮抗半径《10mm ；
ꢀ“
”拮抗半径》10mm。
29.实施例4纺锤链霉菌ls159对多种食品腐败微生物的拮抗作用选择引起食品腐败的常见真菌和细菌各4种为实验材料，采用平板对峙法对纺锤链霉菌ls159的抗菌功能谱进行测定，同时以另一株纺锤链霉菌ls286作对比。4种真菌为黑曲霉（aspergillus niger）、黄曲霉（aspergillusflavus）、扩展青霉（penicillium expansum)）、链格孢菌（alternaria alternata），4种细菌为金黄色葡萄球菌( staphylococcus aureus)、大肠杆菌（escherichia coli）、蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）、凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）。真菌在pda培养基中培养3-5d，细菌在lb液体培养基中培养12-18h。
30.取链霉菌单菌落接种在isp2液体培养基中，30 ℃、150 rpm培养3-5 d，培养好的菌液用于平板对峙实验。对于食品腐败真菌拮抗作用，进行平板对峙实验时在改良pda培养基（即pda培养基与isp2培养基1:1比例混合：pda培养基为200 g去皮马铃薯切成小块后，放
于蒸馏水中煮，待水开后用8层纱布过滤并用蒸馏水补充至1l，加入20g葡萄糖，加16g琼脂粉；isp2培养基为酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，水1l）平板中心接种已活化的0.5cm
×
0.5cm的真菌菌块，在距离腐败真菌2.5cm的两侧对称打孔，每孔加入100μl的链霉菌菌液，每个处理重复3次，在28℃培养箱中培养5-7d，用游标卡尺测定测量腐败真菌直径和拮抗半径。对于食品腐败细菌的拮抗作用，进行平板对峙实验时，取培养好的4种食品腐败细菌各200μl分别涂布在lb改良培养基（即lb培养基与isp2培养基1:1比例混合：lb培养基为nacl10g，酵母浸粉5g，蛋白胨10g，蒸馏水1l，ph7.0-7.5；isp2培养基为酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，水1l）平板上，在平板中间打3个直径为0.7cm孔，孔中加入100μl链霉菌菌液，在30℃培养24-36h，测定抑菌直径。
31.结果表明，纺锤链霉菌ls159对8种引起食品腐败的真菌和细菌均有拮抗作用，其中对扩展青霉（penicilliumexpansum)、金黄葡萄球菌(staphylococcusaureus)和大肠杆菌（escherichiacoli）的拮抗效果最好，对黄曲霉（aspergillusflavus）、链格孢菌（alternariaalternata）和蜡样芽孢杆菌（bacilluscereus）也有较好的抑制效果。而且ls59对8种引起食品腐败的微生物的抑制效果均好于纺锤链霉菌ls286，具体结果见表3。
32.表3纺锤链霉菌ls159对8种食品腐败微生物的抑菌作用注：食品腐败真菌1.黑曲霉（aspergillusniger）、2.黄曲霉（aspergillusflavus）、3.扩展青霉（penicilliumexpansum）、4.链格孢菌（alternariaalternata），食品腐败细菌：1.金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、2.大肠杆菌（escherichiacoli）、3.蜡样芽孢杆菌（bacilluscereus）、4.凝结芽孢杆菌（bacilluscoagulans）。
“‑”
无拮抗；“ ”0《拮抗半径《5mm；“ ”5《拮抗半径《10mm；“ ”拮抗半径》10mm。
33.实施例5利用啤酒废水发酵纺锤链霉菌ls159取纺锤链霉菌ls159单菌落接种在isp2液体培养基中，30℃、150rpm培养3-5d，培养好的菌液待用。在啤酒废水中加入一定量的自来水（啤酒废水与自来水按体积比为1：5），然后添加0.5%的葡萄糖、0.5%的酵母浸粉，调节ph至7.0-7.4，分装到250ml三角瓶中，每瓶50ml，灭菌冷却后按2%的接种量进行接种，32℃、150rpm培养1d、2d、3d、5d、7d用酶标仪测od600值。以isp2培养基接种ls159，在同样条件下接种和培养的处理为对照。
34.结果表明，纺锤链霉菌ls159能够较好地利用啤酒废水为主要成分的培养基，与isp2培养基相比，在培养初期的1-3d，利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌生长速度慢于isp2培养基发酵的处理，但在发酵中后期二者生长量逐渐接近一致。具体结果见图3。
35.实施例6利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌ls159抑菌作用为了确认利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌ls159菌液的抑菌功能是否受影响，按
实施例5的方法获得在啤酒废水中培养5d的纺锤链霉菌ls159发酵液，将其进行抑菌效果研究。抑菌实验所用有害微生物的包括1种植物病原真菌板栗疫病病原菌（cryphonectria parasitica)，1种植物病原细菌胡萝卜软腐病原菌（pectobacterium carotovorum），1种引起食品腐败真菌扩展青霉（penicillium expansum）和1种引起食品腐败细菌金黄色葡萄球菌( staphylococcus aureus)。
36.结果表明（见表4），利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌ls159 菌液的抑菌功能与在isp2培养基上培养的菌液效果一致，说明可以利用啤酒废水发酵拮抗菌纺锤链霉菌。
37.表4利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌ls159菌液抑菌作用注：1. 板栗疫病病原菌（cryphonectria parasitica)、2. 胡萝卜软腐病原菌（pectobacterium carotovorum）、3.扩展青霉（penicillium expansum）、4.金黄色葡萄球菌( staphylococcus aureus)、3.大肠杆菌（escherichia coli）、3.蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）、4.凝结芽孢杆（bacillus coagulans）。“ ”拮抗半径》10mm。