一种发酵咖啡渣制备甘露低聚糖的方法

1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵咖啡渣制备甘露低聚糖的方法。


背景技术：

2.咖啡是世界上最受欢迎的饮料之一，而咖啡渣作为生产速溶咖啡时留下的副产物约占咖啡干豆质量的2/3。每喝一杯现磨咖啡，就会产生30g咖啡渣。目前，国外的咖啡渣主要用作肥料和燃料，国内大多作为废弃物丢弃，造成环境污染和资源浪费。咖啡渣主要成分包括碳水化合物、含氮化合物、脂类化合物以及一些矿质元素，其中碳水化合物含量约为45％，而甘露聚糖含量高达24％左右，是制备甘露低聚糖的优质原料。论文“郭跃平，徐广伟，韦何雯，章银军，沈雪亮.利用咖啡豆渣酶法制备甘露低聚糖的研究.食品研究与开发,2017,38(21):59-64.”中，利用两种不同来源的β-甘露聚糖酶对咖啡豆渣酶解得到的甘露低聚糖得率为50％-60％。而早在2002年，日本agf公司就成功地从咖啡渣中提取了甘露低聚糖，该公司将水与粉碎的咖啡渣混合，然后在220℃高温下使其分解，经过滤、脱色和脱氧后，得到高纯度的甘露低聚糖。两种方法虽然得到了较高纯度的甘露聚糖酶，但经酶解或高温处理后仍有大量杂质未去除，一方面导致咖啡渣的利用率偏低，另一方面导致在分离纯化甘露低聚糖的过程中需要经过较复杂的工艺，同时还增加废水等废弃物的产生，仍然存在较为严重的资源浪费和环境污染等问题，而且导致生产成本居高不下，增加了企业负担。
3.甘露低聚糖又称甘露寡聚糖、低聚甘露糖，广泛存在于魔芋粉、瓜儿豆胶、田菁胶及多种微生物细胞壁内，其作为双歧杆菌增殖因子，具有甜味，所以往往被用作糖替代剂，而且对肠道保护和免疫力的提高等作用，已被广泛地用作食品和饲料添加剂。酶法水解魔芋、瓜尔胶、椰子、刺槐豆胶等原料制备甘露低聚糖，是现今生产常用的方法。而采用发酵制备甘露低聚糖还未见报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术中咖啡渣利用率差的问题，本发明提供一种发酵咖啡渣制备甘露低聚糖的方法，应用灵芝发酵咖啡渣获得较高得率和纯度的甘露低聚糖。
5.本发明是通过以下技术方案实现的：
6.一种发酵咖啡渣制备甘露低聚糖的方法，所述方法包括：
7.原料处理：将咖啡渣烘干、除杂，然后粉碎并过筛；
8.菌种活化：将灵芝菌从斜面上切带培养基的斜面菌丝接入固体培养基，在合适温度下培养一段时间；
9.种子液制备：将带有灵芝菌的固体培养基捣碎，然后加入适量无菌水，得到灵芝种子液；
10.发酵培养：将灵芝种子液与咖啡渣原料粉按一定比例混合，放入发酵罐内，在一定温度下发酵一定时间，且控制发酵罐内空间氧浓度在一定范围；
11.去除杂质：用过滤或离心的方式去除发酵液中的杂质，收集上清液，得到含有甘露低聚糖的溶液。
12.进一步地，采用的所述灵芝菌为赤芝(g.lucidum)、紫芝(g.sinense)、松杉灵芝(g.tsugae murr.)中的一种；卫生部在2001年发布的《可用于保健食品的真菌菌种名单》中，包括了赤芝(ganoderma lucidum)、紫芝(g.sinense)和松杉灵芝(g.tsugae murr.)三种灵芝属真菌。为了保证所得产物未来能够在保健食品中应用，本发明最终选定了赤芝、紫芝和松山灵芝三种灵芝菌。
13.进一步地，菌种活化的步骤具体为：将灵芝菌用接种钩从斜面上切0.5-1cm2带培养基的斜面菌丝接入固体培养基中部，28
±
2℃培养3至6天。其中，固体培养基使用市售符合《gb 4789.15-2016食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，并添加质量百分比为0.3-1.2％的木质素，添加木质素是为了诱导灵芝菌中木质素降解酶系的表达和分泌，从而保证液体发酵过程中的顺利降解，保证木质素的有效降解，木质素添加量低于0.3％无法起到诱导木质素降解酶系表达和分泌的作用，添加量高于1.2％会抑制灵芝的生长，导致后续液体发酵的失败。
14.进一步地，种子液制备步骤具体为：用接种钩将带有灵芝菌的固体培养基捣碎，加入无菌水，无菌水的用量为固体培养基体积的2-5倍，得到灵芝种子液。
15.进一步地，发酵培养步骤具体为：将灵芝种子液与咖啡渣原料粉按质量比(2～5):1的比例混合，放入发酵罐内，28
±
2℃条件下培养5至10天，通过搅拌转速和通气量使发酵罐内空间氧浓度为0.010～0.025mol/l；因灵芝属于好氧型微生物，如果氧气的供应量不足，会造成灵芝生长缓慢，不仅会降低灵芝对纤维素和木质素的分解，最终导致甘露低聚糖的得率偏低，还容易被其他微生物污染，导致发酵失败，为了保证甘露低聚糖的产率，需要严格控制发酵条件。在发酵培养过程中，向发酵培养基中添加酵母粉来补充氮源，酵母粉添加量为：每升发酵培养中添加0.5-5.0g。
16.进一步地，去除杂质步骤中，得到的所述含有甘露低聚糖的溶液中，甘露低聚糖的质量百分比为2.5-6.2％。
17.进一步地，所述方法还包括将所述含有甘露低聚糖的溶液经过滤和活性炭脱色，然后在0.001～0.01mpa，30-40℃条件下减压浓缩后，再经过精制和干燥后得到甘露低聚糖固体，所述甘露低聚糖固体中甘露低聚糖纯度为80％-90％。
18.本发明的有益技术效果：
19.灵芝(ganoderma)是担子菌纲、多孔菌科、灵芝属的一种重要的药、食两用真菌，是我国传统的名贵药材之一。卫生部在2001年发布的《可用于保健食品的真菌菌种名单》中，包括了赤芝(ganoderma lucidum)、紫芝(g.sinense)和松杉灵芝(g.tsugae murr.)三种灵芝属真菌。灵芝在深层发酵过程中，会产生丰富的胞外酶系，如纤维素酶类、半纤维素酶类、淀粉酶类、果胶酶等，这些胞外酶系在胞外可进行多种胞外生化反应，可有效破坏咖啡渣中纤维素、半纤维素和木质素之间的共价键、氢键、酯键等，从而使甘露聚糖释放出来，并进一步降解为甘露低聚糖。同时，灵芝在生长过程中，会大量消耗纤维素等物质，从而简化甘露低聚糖的分离纯化。因此，应用灵芝发酵咖啡渣可获得较高得率和纯度的甘露低聚糖，每千克咖啡渣可得甘露低聚糖160-210克，而现有酶法水解咖啡渣制备甘露低聚糖的得率在50-60％左右，即120-145克左右。本发明提供的方法通过离心去除杂质和灵芝、反渗透膜浓缩
纯化后，可得到纯度为80％-90％的甘露低聚糖。本发明不仅为咖啡渣的高值化利用提供了新色思路，而且开辟了发酵法制备甘露低聚糖的新方法。
20.本方法操作简单、生产条件温和、不污染环境，能耗低，符合节能減排。利用本发明生产甘露低聚糖，可大大降低生产成本和环境污染，还为咖啡渣的高值化利用提供了新色思路，并开辟了发酵法制备甘露低聚糖的新方法。
21.甘露低聚糖的前体物质——甘露聚糖主要存在于半纤维素中，而半纤维素在自然界中通常与纤维素和木质素结合在一起，要高效利用半纤维素，就必须将半纤维素与纤维素和木质素分离，这是目前从咖啡渣中提取甘露低聚糖所面临的主要问题。而通过灵芝来降解纤维素和木质素，一方面解决了将半纤维素从纤维素和木质素中分离出来的问题，另一方面，灵芝在生长和代谢过程中，利用并分解了纤维素和木质素，不仅降低了后续分离纯化的难度，还进一步降低了废渣的数量，提高了咖啡渣的利用率，降低了环境污染的风险。
附图说明
22.图1为本发明实施例中一种发酵咖啡渣制备甘露低聚糖的方法流程图。
具体实施方式
23.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
24.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
25.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.下述实施例中所使用的灵芝为如下种类的菌株：赤芝(ganoderma lucidum)、紫芝(g.sinense)和松杉灵芝(g.tsugae murr.)。各菌株均购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。
27.实施例1
28.本实施例提供一种发酵咖啡渣制备甘露低聚糖的方法，所述方法包括：
29.(1)原料处理：将咖啡渣在80℃的烘箱内烘干后，去除杂质，然后粉碎并过20-40目筛。
30.(2)菌种活化：将赤芝(g.lucidum)用接种钩从斜面上切1cm2带培养基的斜面菌丝接入添加了质量百分比为0.6％木质素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中部，28
±
2℃培养3至5天。
31.(3)种子液制备：用接种钩将带有赤芝的固体培养基捣碎，然后加入适量无菌水，得到赤芝种子液；本实施例中，无菌水的用量为固体培养基体积的2倍；
32.(4)发酵培养：将赤芝种子液与咖啡渣原料粉按质量比5:1的比例混合，并按质量百分比添加了1.5％的酵母粉以补充氮源，放入发酵罐内，28
±
2℃条件下培养7天，控制发酵罐内空间氧浓度为0.025mol/l。
33.(5)去除杂质：用过滤或离心的方式去除破壁匀浆物的杂质，收集上清液，得到甘露低聚糖溶液，参照李道义等(李道义,江正强,韦赟,李里特,日下部功.低聚甘露糖的酶法制备、分离与结晶[j].食品科学,2005(s1):58-60.)的方法检测甘露低聚含量为3.52％。
[0034]
(6)浓缩干燥：甘露低聚糖的溶液经活性炭脱色，然后在0.001～0.01mpa，30-40℃减压浓缩后，再经过精制和干燥后得到甘露低聚糖固体198.8克。参照“郭跃平,徐广伟,韦何雯,章银军,沈雪亮.利用咖啡豆渣酶法制备甘露低聚糖的研究.食品研究与开发,2017,38(21):59-64.”的方法测定甘露低聚糖的平均聚合度dp值为2.83，纯度为83.3％。
[0035]
实施例2
[0036]
本实施例提供一种发酵咖啡渣制备甘露低聚糖的方法，所述方法包括：
[0037]
(1)原料处理：将咖啡渣在80℃的烘箱内烘干后，去除杂质，然后粉碎并过20-40目筛。
[0038]
(2)菌种活化：将紫芝(g.sinense)用接种钩从斜面上切1cm2带培养基的斜面菌丝接入添加了质量百分比为0.8％木质素的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中部，28
±
2℃培养4至5天。
[0039]
(3)种子液制备：用接种钩将带有紫芝的固体培养基捣碎，然后加入适量无菌水，得到紫芝种子液；本实施例中，无菌水的用量为固体培养基体积的4倍；
[0040]
(4)发酵培养：将紫芝种子液与咖啡渣原料粉按质量比2:1的比例混合，放入发酵罐内，28
±
2℃条件下培养7天，控制发酵罐内空间氧浓度为0.02mol/l。
[0041]
(5)去除杂质：用过滤或离心的方式去除破壁匀浆物的杂质，收集上清液，既得甘露低聚糖溶液，参照李道义等(李道义,江正强,韦赟,李里特,日下部功.低聚甘露糖的酶法制备、分离与结晶[j].食品科学,2005(s1):58-60.)的方法检测甘露低聚含量为8.12％。
[0042]
(6)浓缩干燥：甘露低聚糖的溶液经活性炭脱色，然后在0.001～0.01mpa，30-40℃减压浓缩后，再经过精制和干燥后得到甘露低聚糖固体201.7克。参照“郭跃平,徐广伟,韦何雯,章银军,沈雪亮.利用咖啡豆渣酶法制备甘露低聚糖的研究.食品研究与开发,2017,38(21):59-64.”的方法测定甘露低聚糖的平均聚合度dp值为3.22，纯度为84.7％。
[0043]
实施例3
[0044]
本实施例提供一种发酵咖啡渣制备甘露低聚糖的方法，所述方法包括：
[0045]
(1)原料处理：将咖啡渣在80℃的烘箱内烘干后，去除杂质，然后粉碎并过20-40目筛。
[0046]
(2)菌种活化：将松杉灵芝(g.tsugae murr.)用接种钩从斜面上切1cm2带培养基的斜面菌丝接入添加了质量百分比为0.9％木质素的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中部，28
±
2℃培养4至5天。
[0047]
(3)种子液制备：用接种钩将带有松杉灵芝的固体培养基捣碎，然后加入适量无菌水，得松杉灵芝种子液；本实施例中，无菌水的用量为固体培养基体积的5倍；
[0048]
(4)发酵培养：将松杉灵芝种子液与咖啡渣原料粉按质量比3:1的比例混合，放入发酵罐内，28
±
2℃条件下培养8天，控制发酵罐内空间氧浓度为0.022mol/l。
[0049]
(5)去除杂质：用过滤或离心的方式去除破壁匀浆物的杂质，收集上清液，既得甘露低聚糖溶液，参照李道义等(李道义,江正强,韦赟,李里特,日下部功.低聚甘露糖的酶法制备、分离与结晶[j].食品科学,2005(s1):58-60.)的方法检测甘露低聚含量为3.81％。
[0050]
(6)浓缩干燥：甘露低聚糖的溶液经活性炭脱色，然后在0.001～0.01mpa，30-40℃减压浓缩后再经过精制和干燥后得到甘露低聚糖固体177.3克。参照“郭跃平,徐广伟,韦何雯,章银军,沈雪亮.利用咖啡豆渣酶法制备甘露低聚糖的研究.食品研究与开发,2017,38
(21):59-64.”的方法测定甘露低聚糖的平均聚合度dp值为3.45，纯度为86.2％。
[0051]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。