一种与黄瓜果皮亮度基因共分离的InDel分子标记及其应用

一种与黄瓜果皮亮度基因共分离的indel分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与黄瓜果皮亮度基因共分离的indel分子标记及其应用。


背景技术：

2.黄瓜，(cucumis sativus l.,2n＝2x＝14)是葫芦科甜瓜属一种重要的蔬菜作物，产量高，经济效益好，在全世界范围尤其是中国被广泛种植。果皮亮度是黄瓜果实重要的外观品质性状之一，可以直接影响其商品性。在鲜食消费市场上，相比与果皮灰暗的黄瓜果实，果皮光亮的果实因其光鲜油亮的外表深受消费者的喜爱。因此，果皮亮度已经成为影响鲜食黄瓜市场价值的重要因素。在此背景下，研究黄瓜果皮亮度的遗传及分子标记，对于选育受市场欢迎的黄瓜新品种具有重要意义。
3.随着首个黄瓜基因组测序的完成，包括果刺，果皮颜色，果颈等在内的多个调控黄瓜果实外观品质性状的基因被陆续克隆和报道。由于果皮亮度性状的复杂性，导致对该性状的研究进展相对缓慢。自1931年该性状被首次报道后，截至目前还未见有明确的调控基因以及针对该性状的可直接应用于分子标记辅助选择育种的分子标记被报道。受限于此，黄瓜育种从业者在针对该性状培育新品种的过程中无法利用分子标记从苗期进行基因型鉴定和选择，从而造成了人力，物力，财力和时间的极大浪费。


技术实现要素：

4.本发明基于对黄瓜果皮亮度基因的精细定位提供了一种与该性状共分离的indel分子标记。此标记可作为辅助选择手段应用于针对果皮亮度的黄瓜新品种选育进程中，可极大的提高育种效率，缩短育种周期且节约资源。
5.第一方面，本发明提供一种与黄瓜果皮亮度基因共分离的indel分子标记，所述indel分子标记的核苷酸序列如seq id no.3所示。
6.具体地，所述indel分子标记位于黄瓜基因组5号染色体上第20,290,734-20,295,628碱基位。
7.更具体地，黄瓜果皮亮度基因dull的启动子序列和编码序列均位于上述4895bp的插入缺失变异序列中。若黄瓜基因组存在所述4895bp的缺失，则黄瓜果皮亮度；若黄瓜基因组不存在所述4895bp的缺失，则黄瓜果皮亮度低。
8.第二方面，本发明提供检测indel分子标记的引物对，所述引物对如seq id no.1-2所示。
9.若黄瓜基因组中，含有野生型dull基因序列，使用如seq id no.1-2所示所述引物对扩增出如seq id no.3所示的插入缺失变异序列。
10.使用本发明提供的引物对进行检测时，若扩增出5309bp的单一条带或扩增出414bp和5309bp的双条带，说明待测黄瓜材料的果皮呈现灰暗表型；当仅扩增出414bp的单一条带，说明待测黄瓜材料的果皮呈现光亮表型。
11.第三方面，本发明提供一种含有上述引物对的试剂盒，所述试剂盒是用于鉴定黄瓜果皮亮度性状的快速检测试剂盒。
12.根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护，上述的引物对或试剂盒在检测黄瓜果皮亮度基因dull基因型中的应用。
13.以及上述的indel分子标记或上述的引物对或上述的试剂盒在黄瓜分子标记辅助选择育种或种质资源鉴定中的应用。
14.第四方面，本发明提供一种黄瓜果皮亮度性状的快速检测方法，包括：
15.步骤1，将待测黄瓜材料的全基因组dna提取；
16.步骤2，利用如seq id no.1-2所示的引物对进行pcr扩增；
17.步骤3，若扩增出5309bp的单一条带或扩增出414bp和5309bp的双条带时，说明待测黄瓜材料的果皮呈现灰暗表型；若扩增出414bp的单一条带时，说明待测黄瓜材料的果皮呈现光亮表型。
18.进一步地，上述步骤1中待测黄瓜材料dna的提取采用改良的ctab法；
19.进一步地，上述步骤2中pcr扩增所用的dna聚合酶为takara的primer star max，扩增速度为5-10秒/1kb；pcr扩增所用的程序包括：
20.预变性：95℃5分钟；
21.循环：98℃变性15秒；60℃退火25秒；72℃延伸1分钟20秒；共35个循环；
22.延伸：72℃延伸5分钟；
23.保存：4℃保存。
24.本发明的有益效果在于：
25.(1)目前常用的分子标记有ssr、snp、caps、dcaps和indel等。其中ssr分子标记的检测需要聚丙烯酰胺凝胶电泳，操作复杂，所用试剂多对人体和环境有害；snp分子标记虽然密度高，但其仪器设备昂贵，应用门槛高；caps和dcaps分子标记的检测步骤较多，且需要用到各种限制性内切酶，成本较高。相比之下，indel分子标记的检测仅通过pcp扩增和琼脂糖凝胶电泳即可实现，操作简便，成本低廉，高效无毒且应用门槛低。
26.(2)利用本发明所述的indel分子标记对150个f2分离群体和50个自然群体进行果皮亮度预测或鉴定的实验结果表明该分子标记与与黄瓜果皮亮度性状100％连锁，具体表现为：当利用该分子标记扩增出单一5309bp条带或扩增出414bp和5309bp的双条带时，测试黄瓜材料的果皮亮度极低；当利用该分子标记扩增出单一414bp的条带时，测试黄瓜材料的果皮亮度极高。因此本发明报道的indel分子标记可作为辅助选择手段应用于针对果皮亮度的黄瓜新品种选育进程中，可极大的提高育种效率，缩短育种周期且节约资源，此外该分子标记还可用于大规模的黄瓜种质资源中dull基因型或果皮亮度的鉴定。
附图说明
27.图1为本发明实施例1中仅果皮亮度有显著差异的近等基因系材料的果实表型图。
28.图2为本发明实施例2中利用indel-dull分子标记对黄瓜材料2073-1、2073-2和f1中果皮亮度基因dull的基因型进行鉴定的凝胶电泳图谱。
具体实施方式
29.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
30.实施例1与黄瓜果皮亮度基因dull共分离的indel分子标记的获得
31.本实施例提供了与黄瓜果皮亮度基因dull共分离的indel分子标记获取的方法，具体步骤如下：
32.1)材料与试剂
33.2073-1和2073-2是一对通过饱和回交形成的仅果皮亮度有显著差异的近等基因系材料(图1)。2073-1的果实灰暗，2073-2的果实光亮。上述两个材料已在期刊文章(liu b,guan d,zhai x,et al.selection footprints reflect genomic changes associated with breeding efforts in 56 cucumber inbred lines[j].horticulture research 2019,6(127).)中公开。本实施例所用引物均由上海生工生物合成，均为page级纯化且通过hplc质检。其余所用试剂均为常用分子生物学试剂。
[0034]
2)黄瓜果皮亮度性状的遗传规律统计
[0035]
在本发明中，为了探明黄瓜果皮亮度性状的遗传规律，利用近等基因系2073-1(p1)和2073-2(p2)构建了f1杂交群体，并以此为基础进一步创制了回交群体和f2分离群体。f1果实表现出像2073-1一样的灰暗表型。在f2群体中，灰暗与光亮植株的比例为3.05：1(1119：367)，经卡方检验证实为3：1(χ2＝0.06《χ
2 0.05
＝3.841)。bc1p2群体中灰暗与光亮植株的比例为1.17：1(123：105)，经卡方检验证实为1：1(χ2＝1.27《χ
2 0.05＝3.841)，所有植物bc1p1回交群体表现出灰暗表型。上述遗传分析表明，黄瓜果皮亮度性状由单个隐性基因控制(表1)。
[0036]
表1黄瓜果皮亮度性状的遗传规律统计
[0037][0038]
3)黄瓜果皮亮度基因的精细定位
[0039]
分离群体混合分析是快速定位基因的一个有效途径。在1486个f2植株中，本发明选择了50个拥有灰暗果实和50个拥有光泽果实的单株，分别构建了两个极端的dna池：dull池和glossy池。本发明还用p1(2073-1)和p2(2073-2)构建了两个亲本池。随后，本发明对上述4个混池进行了高通量测序。基于bsa结果，得到1个与黄瓜果皮亮度性状关联的区域即chr5：17,358,895～20,945,460，总长度为3.59mb，共包含435个基因。
[0040]
随后，在该区间内开发了一系列indel标记和snp标记用于精细定位并最终将控制黄瓜果皮亮度的基因dull定位在了5号染色体上一个24.5kb的区间内。
[0041]
4)与黄瓜果皮亮度基因共分离indel分子标记的开发
[0042]
本发明克隆并测序了来自2073-1和2073-2的上述定位区间的基因组dna序列。通过序列比对，发现2073-2基因组该区间内存在一个4895bp的缺失片段。紧接着，基于该缺失片段设计了一个indel分子标记，即indel-dull。检测该分子标记的核苷酸序列如seq id no.1-2所示。
[0043]
实施例2 indel分子标记在鉴定黄瓜果皮亮度基因dull基因型中的应用
[0044]
本实施提供，使用indel分子标记鉴定黄瓜果皮亮度基因dull基因型鉴定的方法，如下：首先，提取待测黄瓜材料的全基因组dna；其次，利用所述的indel分子标记进行pcr扩增；最后，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带的长度并判断待测材料的基因型，其中与参考品种2073-1序列一致的dull基因型可扩增出5309bp的单一条带，存在上述4895bp缺失变异的dull等位基因型可扩增出414bp的单一条带，杂合型则可扩增出414bp和5309bp的双条带(图2)。
[0045]
实施例3 indel分子标记在预测或鉴定黄瓜果皮亮度中的应用
[0046]
本实施例利用indel-dull标记对200个f2分离群体(50个光亮果皮，150个灰暗果皮)和60个自然群体(20个光亮果皮，40个灰暗果皮)进行了果皮亮度的鉴定。
[0047]
indel-dull分子标记在f2分离群体中的带型和表型统计信息见表2。indel-dull分子标记在自然群体中的带型和表型统计信息见表3。实验结果表明indel-dull分子标记与黄瓜果皮亮度性状100％连锁，具体表现为：当利用indel-dull分子标记扩增出单一5309bp条带或扩增出414bp和5309bp的双条带时，测试黄瓜材料的果皮呈现灰暗表型；当利用该分子标记扩增出单一414bp的条带时，测试黄瓜材料的果皮呈现光亮。
[0048]
可见，本发明报道的indel分子标记与黄瓜果皮亮度性状共分离，通过简单的pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳检测即可对黄瓜材料的果皮亮度进行早期的、无损伤的、简单高效的预测或鉴定。因此本发明报道的indel分子标记可作为辅助选择手段为黄瓜果皮亮度的遗传改良提供便利，可极大的提高育种效率，缩短育种周期且节约资源，此外该分子标记还可用于大规模的黄瓜种质资源中dull基因型或果皮亮度的快速鉴定。
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表2 indel-dull分子标记在f2分离群体中的带型和表型统计
[0050]
[0051]
[0052]
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[0055][0056]
表3 indel-dull分子标记在自然群体中的带型和表型统计
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[0058]
[0059][0060]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。