一种没食子酸对甲基苯乙酯及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及化妆品技术领域，尤其涉及一种没食子酸对甲基苯乙酯及其制备方法和应用。


背景技术：

2.年轻和美白是人们追求的永恒主题，具体为追求人体皮肤的美白，有光泽，延缓皮肤衰老。皮肤是人体体表最大的器官，长期与外部环境直接接触，易受到外部环境的刺激性物质，光纤(主要为紫外线)等伤害，使得皮肤容易老化、损伤、色素沉积等，从而影响人体美观。
3.黑色素是影响皮肤白皙最主要的一类色素，黑色素在黑素细胞内生成后，成熟的黑色素小题将沿着黑色素细胞树突伸展方向转移并传递至周围的角质形成细胞内，从而发挥调解皮肤颜色和防护紫外线辐射的作用。黑素运输阻断剂能够降低黑素小体向角质细胞的传递速度，减少各表皮细胞层的黑素含量，达到美白作用。如烟酰胺、壬二酸、绿茶提取物等。黑色素分布于角质形成细胞后会随角质细胞脱落，黑色素沉积于皮肤表面会引起可见的肤色改变或斑点。因此可以通过促进皮肤角质层的代谢，加速老化角质细胞的脱落，从而加速了黑色素的代谢，改善皮肤的肤色和外观。
4.皮肤受损主要表现为细胞内水分流失，氧化自由基损伤，细胞基质分泌减少等。皮肤衰老使皮肤对机体的防护能力，调节能力等减退，由此皮肤不能适应内外环境的变化，出现颜色、色泽、形态和质感等外观整体状况的改变。皮肤的老化分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是指皮肤随年龄增长的自然老化。表现为皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等。外源性老化的最主要原因是日晒所致的光老化。表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色素斑形成等。因此，同时具有抗衰老和美白作用的成分在化妆品领域具有广阔应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种没食子酸对甲基苯乙酯及其制备方法和应用，所述没食子酸对甲基苯乙酯同时具有抗衰老和美白的作用。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种没食子酸对甲基苯乙酯，具有式1所示结构：
8.9.本发明还提供了上述技术方案所述没食子酸对甲基苯乙酯的制备方法，包括以下步骤：
10.将没食子酸、对甲基苯乙醇、酸液和有机溶剂混合，进行酯化反应，得到所述没食子酸对甲基苯乙酯。
11.优选的，所述酸液包括硫酸、盐酸、硝酸和三氟乙酸中的一种或几种。
12.优选的，所述有机溶剂包括二氧六环、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、n,n-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或几种。
13.优选的，所述没食子酸和对甲基苯乙醇的摩尔比为1:(1～5)。
14.优选的，所述酯化反应的温度为20～80℃，时间为1～5h。
15.本发明还提供了上述技术方案所述没食子酸对甲基苯乙酯或上述技术方案所述的制备方法制备得到的没食子酸对甲基苯乙酯在制备具有抗衰老、美白功效化妆品中的应用。
16.优选的，所述抗衰老为所述没食子酸对甲基苯乙酯通过保护h2o2损伤的hsf细胞和hacat细胞，促进hacat细胞分泌透明质酸和ⅰ型胶原蛋白和/或具有dpph自由基清除活性实现。
17.优选的，所述美白为所述没食子酸对甲基苯乙酯通过具有酪氨酸酶抑制活性实现。
18.本发明提供了一种没食子酸对甲基苯乙酯，具有式1所示结构：
[0019][0020]
皮肤受损老化主要是由于氧化自由基导致的皮肤细胞损伤、基质分泌减少、细胞内水分流失、防护能力下降等。而酪氨酸酶是调控黑色素生成的限速酶，通过催化酪氨酸产生黑色素，酪氨酸酶的表达和活性决定着黑色素生成的速度和数量。因此，通过抑制皮肤细胞的氧化损伤，促进细胞基质的分泌，抑制酪氨酸酶活性等，可发挥抗衰老和美白作用。本发明提供的没食子酸对甲基苯乙酯对h2o2损伤的hsf细胞和hacat细胞具有保护作用，促进hacat细胞分泌透明质酸(ha)和i型胶原蛋白(colⅰ)，具有显著的dpph自由基清除活性，具有显著的酪氨酸酶抑制活性。可作为抗衰老、美白的化妆品组分，应用于各种化妆品中。
附图说明
[0021]
图1为没食子酸对甲基苯乙酯对dpph自由基的抑制率；
[0022]
图2为没食子酸对甲基苯乙酯对dpph自由基对酪氨酸酶的抑制率。
具体实施方式
[0023]
本发明提供了一种没食子酸对甲基苯乙酯，具有式1所示结构：
[0024][0025]
本发明还提供了上述技术方案所述没食子酸对甲基苯乙酯的制备方法，包括以下步骤：
[0026]
将没食子酸、对甲基苯乙醇、酸液和有机溶剂混合，进行酯化反应，得到所述没食子酸对甲基苯乙酯。
[0027]
在本发明中，所述没食子酸对甲基苯乙酯的制备流程如式2所示：
[0028][0029]
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
[0030]
在本发明中，所述酸液优选包括硫酸、盐酸、硝酸和三氟乙酸中的一种或几种；当所述酸为上述具体选择中的两种以上时，本发明对上述具体物质的配比没有任何特殊的限定，按任意配比进行混合即可。本发明对所述酸液的浓度没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的浓度即可。
[0031]
在本发明中，所述有机溶剂优选包括二氧六环、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、n,n-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或几种，当所述有机溶剂为上述具体选择中的两种以上时，本发明对上述具体物质的配比没有任何特殊的限定，按任意配比进行混合即可。
[0032]
在本发明中，所述没食子酸和对甲基苯乙醇的摩尔比优选为1：(1～5)，更优选为1:3。
[0033]
在本发明中，所述没食子酸和酸液中的酸的摩尔用量比优选为1：(0.05～0.1)。在本发明中，当所述酸液为硫酸时，所述硫酸的用量优选为没食子酸摩尔量的5％；当所述酸液为盐酸时，所述盐酸的用量优选为没食子酸摩尔量的10％；当所述酸液为硝酸时，所述硝酸的用量优选为没食子酸摩尔量的5％；当所述酸液为三氟乙酸时，所述三氟乙酸的用量优选为没食子酸摩尔量的10％。
[0034]
在本发明中，所述没食子酸和有机溶剂的用量比优选为1mol：1l。
[0035]
在本发明中，所述混合优选为将没食子酸、对甲基苯乙醇和有机溶剂混合后，在搅拌的条件下加入酸。本发明对所述搅拌的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。
[0036]
在本发明中，所述酸液的作用是作为催化剂促进酯化缩合。
[0037]
在本发明中，所述酯化反应的温度优选为20～80℃，更优选为30～60℃，最优选为50℃，时间优选为1～5h，更优选为1～3h，最优选为1h。
[0038]
所述酯化反应完成后，本发明还优选包括将得到的残渣溶于正丁醇后，依次用饱
和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液进行洗涤，无水硫酸钠干燥和柱层析；本发明对所述洗涤、干燥和柱层析的具体过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。
[0039]
本发明还提供了上述技术方案所述没食子酸对甲基苯乙酯或上述技术方案所述的制备方法制备得到的没食子酸对甲基苯乙酯在制备具有抗衰老、美白功效化妆品中的应用。
[0040]
在本发明中，所述抗衰老优选为所述没食子酸对甲基苯乙酯通过保护损伤h2o2的hsf细胞和hacat细胞，促进hacat细胞分泌透明质酸和提高ⅰ型胶原蛋白活性和/或具有dpph自由基清除活性实现。
[0041]
在本发明中，所述美白优选为所述没食子酸对甲基苯乙酯通过具有酪氨酸酶抑制活性实现。
[0042]
下面结合实施例对本发明提供的没食子酸对甲基苯乙酯及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0043]
实施例1
[0044]
将没食子酸(170mg，1mmol)与对甲基苯乙醇(408mg，3mmol)溶于1ml 1,4-二氧六环，在搅拌的条件下，加入5mg浓硫酸(50mmol)，50℃反应1h，反应结束后将得到的残渣溶于10ml正丁醇，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(5ml)、饱和氯化钠(5ml)溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，柱层析，得到175mg没食子酸对甲基苯乙酯(收率为61％，分子式为c
16h16
o5，分子量为288，性状：白色粉末)。
[0045]
所述没食子酸对甲基苯乙酯的表征结果：
[0046]
hresims m/z 287.0927(计算值287.0920,[m
–
h]
–
).1h nmr(cd3od):δh7.16(2h,d,j＝8.0hz,h-3'/5'),7.11(2h,d,j＝8.0hz,h-2'/6'),7.05(2h,s,h-2/6),4.40(2h,t,j＝6.7hz,h-8'),2.98(2h,t,j＝6.7hz,h-7'),2.30(3h,s,h-9').
13
c nmr(cd3od):δ
c 167.1(c,c-7),145.1(c,c-3/5),138.4(c,c-4),135.7(c,c-1'),135.0(c,c-4'),128.7(ch,c-3'/5'),128.5(ch,c-2'/6'),120.3(c,c-1),108.7(ch,c-2/6),65.2(ch2,c-8'),34.4(ch2,c-7'),19.7(ch3,c-9')。
[0047]
测试例
[0048]
dpph自由基清除活性测试：
[0049]
材料：
[0050]
1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，dpph)购自北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇(ethanol)购自四川西陇科学有限公司；
[0051]
仪器：
[0052]
varioskan lux台式多功能酶标仪(thermo scientific，美国)；分析天平(ag135,metlertoledo，中国)；
[0053]
实验过程：
[0054]
1)用无水乙醇将dpph配成100μm的工作液；
[0055]
2)在96孔板中，每孔加入100μl的dpph工作液和100μl待测样品，每组设置3个重复孔；
[0056]
3)室温放置30min；
[0057]
4)使用酶标仪在517nm波长下测量吸光度值，通过公式：抑制率＝(对照组-实验组)/对照组
×
100％，计算抑制率，并用统计软件graphpadprism 6计算ic50；
[0058]
结果如图1所示，由图1可知，没食子酸对甲基苯乙酯对dpph自由基的作用呈现明显的量效关系，具有显著的dpph自由基清除活性，其ic
50
为1.80μg/ml；
[0059]
酪氨酸酶抑制活性测试：
[0060]
材料：
[0061]
酪氨酸酶(tyrosinase，tyr)购自北京索莱宝科技有限公司；l-多巴(l-dopa)购自mce公司；pbs购自武汉赛维尔生物科技有限公司；
[0062]
仪器：
[0063]
varioskan lux台式多功能酶标仪(thermo scientific，美国)；分析天平(ag135，metlertoledo，中国)；恒温箱(dhp-9082，上海)；
[0064]
实验过程：
[0065]
1)用pbs将酪氨酸酶配成100u/ml的工作液；
[0066]
2)称取4mg l-多巴溶于10mlpbs，配成2mm工作液；
[0067]
3)在96孔板中，每孔加入50μl的l-多巴工作液和100μl待测样品，每组设置样品测试孔和样品对照孔；
[0068]
4)混匀后，37℃放置5min；
[0069]
5)在样品测试孔中，加入50μl酪氨酸酶工作液，在样品对照孔中加入50μlpbs；
[0070]
6)混匀后，37℃放置5min；
[0071]
7)使用酶标仪在475nm波长下测量吸光度值，通过公式：抑制率＝[(实验对照组孔-背景对照孔)-(样品测试孔-样品对照孔)]/(实验对照组孔-背景对照孔)
×
100％计算抑制率，并用统计软件graphpad prism 6计算ic50，测试结果如图2所示，由图2可知，没食子酸对甲基苯乙酯具有显著的酪氨酸酶抑制活性，并呈现一定的量效关系，在200μg/ml时，抑制率达到42％；
[0072]
对h2o2损伤的hsf细胞和hacat细胞具有保护作用的测试：
[0073]
材料：
[0074]
人皮肤成纤维细胞(hsf)，人永生化表皮细胞(hacat)购自北京北纳创联生物技术有限公司；培养基(dulbecco's modified eagle medium,dmem)购自thermo fisher scientific(苏州，中国)；血清(fetal bovine serum,fbs)购自life technologies(ny，usa)；过氧化氢(h2o2)购自西陇科学(四川，中国)；
[0075]
仪器：
[0076]
全波长扫描式多功能酶标仪(thermofishervarioskan lux,美国)；二氧化碳培养箱(thermo 3111，美国)；生物安全柜(thermo 1300seriesa2,美国)。
[0077]
实验过程：
[0078]
1)取对数期生长的细胞，弃去旧培养基，用pbs清洗两遍，弃去pbs；
[0079]
2)用0.25wt％的胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察到细胞轮廓加深并有变圆趋势时，迅速吸去胰蛋白酶；
[0080]
3)用含10wt％fbs的dmem完全培养基终止消化并重悬细胞，取10μl细胞悬液，用细胞计数仪计数，并用培养基调整细胞浓度至3
×
104/ml，接种在96孔板上，每孔加入100μl细
胞悬液，在37℃，5vol％co2的培养箱中孵育24h，使细胞贴壁；
[0081]
4)吸弃培养基，将完全培养基配制的1mm h2o2加入造模损伤孔中，每孔加入100μl，对照组加等量完全培养基，培养箱中继续孵育1h；
[0082]
5)吸弃h2o2，pbs清洗两遍，弃去pbs，将稀释好的样品加入板中，每孔加入100μl，每个浓度设置3个复孔，培养箱中继续孵育24h；
[0083]
6)吸去培养基，加入配好的mtt溶液(1mg/ml)，每孔加入100μl，培养箱中孵育4h；
[0084]
7)吸去mtt溶液，加入dmso，每孔加入100μl，培养箱中孵育10min；
[0085]
8)使用酶标仪在490nm波长下测量吸光度值，通过公式：修复率＝(实验组-模型组)/(对照组-模型组)
×
100％计算，并用统计软件graphpad prism 5作图，实验重复3次。
[0086]
结果：
[0087]
没食子酸对甲基苯乙酯对h2o2损伤的hsf和hacat细胞具有一定的保护作用。如表1所示，没食子酸对甲基苯乙酯在浓度为10μg/ml时，对h2o2损伤的hsf细胞修复率达34.9％，对hacat细胞的修复率达15.2％。
[0088]
表1.没食子酸对甲基苯乙酯对h2o2损伤的hsf和hacat细胞的修复活性
[0089][0090]
促进hacat细胞分泌透明质酸(ha)和ⅰ型胶原蛋白(co1ⅰ)活性测试：
[0091]
材料：
[0092]
人永生化表皮细胞(hacat)购自北京北纳创联生物技术有限公司；培养基(dulbecco's modified eagle medium，dmem)购自thermo fisher scientific(苏州，中国)；血清(fetal bovine serum,fbs)购自life technologies(ny，usa)；(四川，中国)；透明质酸定量检测试剂盒(haelisakit)购自武汉华美生物工程有限公司(武汉，中国)；ⅰ型胶原定量检测试剂盒(colⅰelisakit)购自武汉华美生物工程有限公司(武汉，中国)。
[0093]
仪器：
[0094]
全波长扫描式多功能酶标仪(thermofishervarioskan lux,美国)；二氧化碳培养箱(thermo 3111，美国)；生物安全柜(thermo 1300seriesa2,美国)，低温离心机(eppendorfcentrifuge 5415r，美国)；
[0095]
实验过程：
[0096]
1)取对数期生长的细胞，弃去旧培养基，用pbs清洗两遍，弃去pbs；
[0097]
2)用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察到细胞轮廓加深并有变圆趋势时，迅速吸去胰蛋白酶；
[0098]
3)用含10wt％fbs的dmem完全培养基终止消化并重悬细胞，取10μl细胞悬液，用细胞计数仪计数，并用培养基调整细胞浓度至1
×
104/ml，接种在96孔板上，每孔加入100μl细胞悬液，在37℃，5vol％co2的培养箱中孵育24h，使细胞贴壁；
[0099]
4)吸弃培养基，将稀释好的样品加入板中，每孔加入100μl，每个浓度设置3个复
孔，培养箱中继续孵育48h；
[0100]
5)吸取上清培养基，4℃，1000g离心20min，取上清液待测；
[0101]
6)按照ha和colⅰ检测试剂盒说明操作，检测colⅰ和ha的含量；
[0102]
8)使用酶标仪在450nm波长下测量吸光度值，通过公式：增长率＝(实验组-阴性)/阴性
×
100％计算，并用统计软件graphpadprism 5作图，实验重复3次。
[0103]
结果：
[0104]
如表2所示，没食子酸对甲基苯乙酯能促进hacat细胞分泌透明质酸(ha)和i型胶原蛋白(colⅰ)，在浓度5.0和10.0μg/ml时，对ha分泌的促进率分别为20.3％和10.8％；对colⅰ分泌的促进率分别为11.7％和15.0％。
[0105]
表2.没食子酸对甲基苯乙酯促ha和coli分泌活性
[0106][0107]
综上可知，本发明所述没食子酸对甲基苯乙酯对h2o2损伤的hsf细胞和hacat细胞具有保护作用，促进hacat细胞分泌透明质酸(ha)和ⅰ型胶原蛋白(co1ⅰ)，具有显著的dpph自由基清除活性，具有显著的酪氨酸酶抑制活性，可作为抗衰老、美白的化妆品组分，应用于各种化妆品中。
[0108]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。