无钩状效应的抗人CD73单克隆抗体的制作方法

无钩状效应的抗人cd73单克隆抗体
技术领域：
1.本发明涉及基因工程抗体，特别涉及一种全新序列的无钩状效应的抗人cd73单克隆抗体。


背景技术：

2.cd73(ecto-5
’‑
nucleotidase，胞外-5
‘‑
核苷酸酶)，是多功能的胞外核酸酶，在大多数实体瘤中呈高表达，cd73可以促进肿瘤细胞的增殖，并与肿瘤分期、病理类型以及预后转归密切相关。
3.目前大部分cd73抗体都面临着“钩状效应”(hook效应)的困扰，即随着抗原抗体量效关系的改变，抗体的治疗效果在达到峰值后伴随抗体浓度的增加开始出现负增长。因此针对不同类型的差异个体，抗体最佳使用剂量难以确定，导致实际治疗效果不佳。比如治疗型cd73单克隆抗体medi-9447。
4.因此，获得无钩状效应的抗人cd73抗体，可以提供更适于临床应用的抗肿瘤制剂。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供可以有效抑制cd73活性的单克隆抗体，用于制备治疗肿瘤相关疾病的药物。
6.本发明用人cd73蛋白免疫babl/c小鼠后经杂交瘤筛选得到全新的抗人cd73单克隆抗体；所述单克隆抗体型别为igg型。
7.本发明获得的抗人cd73单克隆抗体的重链和轻链序列，与现有技术抗人cd73单克隆抗体均完全不同；
8.本发明所用的人cd73蛋白为申请人自主表达的人源cd73蛋白，所用的小鼠为babl/c小鼠。
9.具体的，本发明通过如下手段完成了上述工作：
10.a人源cd73蛋白作为抗原以30μg/只免疫babl/c小鼠，三周后同样剂量加强免疫；
11.b elisa法测定免疫后小鼠血清中的抗体滴度，达到理想效果后以50μg剂量冲击免疫；
12.c取免疫成功的小鼠脾细胞与sp2/0细胞进行融合，待细胞长成细胞团后进行上清滴度检测，通过三轮亚克隆获得阳性单克隆细胞株；
13.d单克隆细胞株扩大培养后进行小鼠腹腔注射制备腹水，并从收集的腹水纯化得到相应的抗体；
14.e利用spr技术进行单克隆抗体的亲和动力学测定；
15.f测定单克隆抗体对于cd73酶活性的抑制作用；
16.g测定单克隆抗体对于移植瘤模型的肿瘤抑制作用。
17.本发明获得的抗人cd73单克隆抗体命名为7-c10-ba-c2。此抗体特异性的分子基础主要来自于它的重链和轻链的高度可变区cdr1、cdr2和cdr3，这些区域是与抗原结合的
ba-c2的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；
40.seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6，分别是抗人cd73单克隆抗体7-c10-ba-c2的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；
41.seq id no.7、seq id no.8，分别是抗人cd73单克隆抗体7-c10-ba-c2重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
具体实施方式
42.为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下实施例对本发明进行了进一步详细说明。应当理解，实施例中所使用的具体方法、试剂等仅用于举例说明本发明，并不能限定本发明的范围。
43.本发明提供特异性的抗人cd73单克隆抗体的重链和轻链序列。所述单克隆抗体由人cd73蛋白免疫babl/c小鼠后经杂交瘤筛选得到的对应的单克隆细胞株表达；所述单克隆抗体型别为igg型。
44.以下实施例中所用的抗原为自主表达的人源cd73蛋白，蛋白c端包含6
×
his标签；
45.所使用的免疫佐剂为北京博奥龙免疫技术有限公司的5周快速免疫佐剂(货号：kx0210041)，初次免疫21天后加强免疫一次，细胞融合前使用抗原冲击免疫一次即可进行细胞融合；
46.所使用的融合方法为电融合法，电融合仪为btx公司的ecm2001型，所用融合缓冲液为原厂细胞融合液(货号：47-0001)；
47.融合后的细胞长出细胞团后采用elisa检测上清抗体表达，酶标板包被人cd73蛋白或者his蛋白，his蛋白用来排除anti-his的假阳性孔；
48.阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆共进行三轮，最终获得阳性单克隆细胞株；
49.阳性单克隆进行腹水制备后纯化，获得对应的单克隆抗体，单克隆抗体进一步用于亲和力测定、cd73酶活抑制实验以及动物药效评价。
50.以下实施例中所述“7-c10-ba-c2”为本发明提供的抗人cd73单克隆抗体的名称。
51.实施例1抗原免疫、细胞融合以及阳性克隆的筛选和腹水抗体的制备纯化
52.实验目的：
53.采用自主表达的人源cd73蛋白作为抗原制备单克隆抗体。
54.实验方法：
55.使用杂交瘤技术制备抗人cd73单克隆抗体。具体方法为：
56.使用30μg人cd73蛋白对4-6周的雌性babl/c小鼠进行免疫。
57.首次免疫后第21天采用同样方法加强免疫一次。
58.首次免疫后第35天通过眼眦采血分离血清进行血清滴度的elisa测定。
59.抗体滴度达到要求后采用50μg人cd73蛋白进行抗原冲击免疫。
60.冲击免疫3天后取脾细胞与sp2/0细胞进行电融合，待细胞成团后elisa检测杂交瘤上清液中的抗人cd73抗体滴度。
61.实验结果：
62.经过三轮亚克隆，通过亲和力以及cd73酶活抑制双重筛选，最终获得了抗人cd73
抗体高表达单克隆细胞株，命名为7-c10-ba-c2。将单克隆细胞扩增后进行腹水制备纯化抗体，用于后续亲和力测定、cd73酶活抑制实验以及动物药效测定。
63.经验证，所得单克隆抗体具有高亲和力，可以有效抑制cd73酶活且无钩状效应，同时，动物药效显示了理想的抑瘤效果。
64.实施例2 7-c10-ba-c2单克隆抗体与重组人cd73亲和动力学分析
65.实验目的：
66.采用biacore t200系统检测7-c10-ba-c2单克隆抗体和对照抗体的亲和动力学常数。
67.试剂和方法：
68.mouse antibody capture kit为购自ge公司的商品化试剂盒，采用氨基偶联的方法将抗小鼠fc igg固定在cm5传感器芯片上，通过偶联的抗小鼠fc igg捕获被测抗体，然后注射一系列浓度梯度的人cd73蛋白，进样完成后采用试剂盒自带的ph 1.7的glycine-hcl再生检测芯片。
69.运行缓冲液为hbs-ep (10mm hepes，ph7.4，150mm nacl，3mm edta和0.05％p20)，测定温度25℃；
70.实验中选用的对照物为medi-9447；medi-9447为medimmune公司的抗cd73单克隆抗体，我们依据其专利(us2016/0194407a1)的序列合成表达并纯化得到对照物并命名为contbody。
71.使用biacore t200评估软件，根据1：1结合模型拟合数据，计算结合(ka)和解离(kd)速率常数以及平衡常数(kd)。
72.实验结果：
73.根据检测结果，本发明和对照抗体亲和力结果数据见图1、图2和下表：
74.实验抗体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)本发明抗体7-c10-ba-c27.721
×
1043.214
×
10-5
4.162
×
10-10
对照物抗体medi-94472.785
×
1053.912
×
10-5
1.405
×
10-10
75.结果显示，7-c10-ba-c2单克隆抗体与重组人cd73具有高亲和力，其亲和力与对照物相当。
76.实验结论：
77.本发明获得的7-c10-ba-c2单克隆抗体与人cd73具有高亲和力。
78.实施例3 7-c10-ba-c2单克隆抗体对cd73酶活性的抑制
79.实验目的：
80.分别从生化水平和细胞水平检测7-c10-ba-c2单克隆抗体抑制cd73酶活的能力。
81.实验方法：
82.1、生化方法
83.将7-c10-ba-c2单克隆抗体以及对照物medi-9447(contbody)以合适的浓度梯度加至96孔白板底部，然后每孔加cd73蛋白至终浓度为0.25μg/ml，37℃孵育15min，孵育结束后分别添加amp和atp至终浓度为500μmol/l和100μmol/l，37℃孵育30min。最后，每孔加入等体积的cell titer glo。
84.酶标仪化学发光法检测各孔信号值，计算并处理数据；
85.2、细胞方法
86.将7-c10-ba-c2单克隆抗体以及对照物medi-9447(contbody)以合适的浓度梯度加至96孔板底部，a549细胞消化重悬后计数，以1
×
105个/孔的密度接种至对应的孔，二氧化碳培养箱孵育15min，孵育结束后将amp加至各孔，终浓度为500μmol/l，二氧化碳培养箱继续孵育24h；24h后将96孔板取出1000rpm离心5min，每孔取50μl上清至新的96孔白板对应位置，之后每孔加入atp溶液至终浓度为100μmol/l，然后每孔加入等体积的cell titer glo。
87.酶标仪化学发光检测各孔信号值，计算并处理数据。
88.实验结果：见图3、图4
89.各抗体cd73酶活抑制效应ec50汇总见下表，其中对照物为medi-9447(contbody)：
[0090][0091]
7-c10-ba-c2在生化水平和细胞水平对cd73酶活的抑制作用与对照物medi-9447(contbody)相当；而medi-9447对酶活的抑制随着抗体浓度的升高其抑制活性开始逐渐下降,酶活曲线呈现钩状(钩状效应)。区别于对照物medi-9447，随着抗体浓度升高7-c10-ba-c2对cd73酶活的抑制始终维持在高水平，并未呈现钩状效应；
[0092]
实验结论：
[0093]
生化水平实验和细胞水平实验都显示，本发明获得的抗cd73单克隆抗体具有高效的cd73酶活抑制作用。
[0094]
实施例4 7-c10-ba-c2单克隆抗体的动物药效评价
[0095]
实验目的：体内实验测试7-c10-ba-c2单克隆抗体抑制肿瘤细胞生长效果。
[0096]
实验方法：
[0097]
取90只b-ndg小鼠，至少适应性饲养一周。
[0098]
培养a375细胞，隔天传一次代，最后收集细胞，pbs将细胞终浓度调整到5*107/ml，每只0.1ml接种到小鼠右侧肩部皮下。
[0099]
接种后10天左右，选取肿瘤体积20-30mm3的小鼠进行分组，每组10只，共3组。
[0100]
分组当天复苏pbmc细胞，pbs将细胞浓度调整到25million/ml，每只小鼠i.v.注射200μl(5millon)pbmc，然后i.v.给药，给药后每周测量2次肿瘤体积；给药频率为q3d，共10次。
[0101]
以肿瘤体积为纵坐标、给药时间为横坐标绘制各组肿瘤生长曲线；各药物组分别与对照组进行one way anova分析，比较两者之间的差异,*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001。
[0102]
实验结果：见图5。实验结果表明，与对照组igg相比，7-c10-ba-c2单克隆抗体显示出显著的抑制肿瘤细胞生长的效果。
[0103]
实验结论：
[0104]
本发明的抗cd73单克隆抗体7-c10-ba-c2具有显著抑制肿瘤细胞生长的作用。