一种利用脉冲电场提高豌豆分离蛋白柔性的方法及其应用

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1.本发明涉及蛋白改性技术领域，具体涉及一种利用脉冲电场提高豌豆分离蛋白柔性的方法及其应用。


背景技术：

2.植物蛋白作为动物蛋白的替代品已成为未来食品的发展趋势。在各种植物蛋白中，豌豆分离蛋白由于其生物可及性、高营养性和低过敏性受到越来越多的关注。然而，豌豆分离蛋白的功能特性如溶解度、乳化性、凝胶性、起泡性和抗氧化能力等方面存在一定局限，无法满足未来食品的需求。因此，常常需要对蛋白进行改性以改善其功能特性来满足食品工业的要求。
3.许多研究表明，多酚类物质可以诱导蛋白质在界面的展开和重排，与蛋白质发生非共价或共价相互作用从而改善蛋白质的溶解性、乳化性和抗氧化性等功能特性。然而，由于蛋白质的内部结构紧凑，因此多酚作为小分子只能与蛋白质表面的氨基酸发生相互作用，这极大的限制了蛋白与多酚的结合率。相比而言，结构展开的蛋白质由于多酚对氨基酸残基的可及性更强，则具有更好的结合多酚的能力。豌豆分离蛋白中70％～80％是球状蛋白，结构紧凑，这强烈限制了它与多酚的结合。因此，如果能借助一些改性方法来促进豌豆分离蛋白结构展开，这将会提高其与多酚的结合能力。
4.蛋白的化学改性方法如有限酶解、酸碱化、磷酸化、糖基化等，但是其操作成本较高、体系较复杂且可能存在安全因素。相比之下，物理改性方法较温和，无需添加外源试剂，是一种更加安全的蛋白质改性手段。中国发明专利202210536654.0公布了一种通过高压微射流和微波辐射对牛奶酪蛋白进行改性的方法，改性后的蛋白与多酚相结合，提高了蛋白的抗氧化性和多酚的生物利用率。然而该操作流程比较复杂，对设备的要求高，需要经过40mpa的高压环境循环处理3次，之后经过600w，4min的微波辐射处理。2)中国发明专利202110588445.6公布了一种通过超声预处理大豆分离蛋白的方法，改性后的蛋白与儿茶素相结合，提高了蛋白的起泡性和抗氧化能力。然而该方法的操作流程也相对复杂，对实际操作过程中要求较高，需要严格控制反应时间间隔。该方法需要经过500w超声处理10min(处理5s，间隔5s)，以防止热效应的产生。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种利用脉冲电场提高豌豆分离蛋白柔性的方法及其应用，采用脉冲电场预处理，作用时间短、作用条件温和，同时能够显著提高豌豆分离蛋白的结构柔性，促进豌豆分离蛋白结构展开，显著提高蛋白结合多酚的能力，从而显著增强蛋白的抗氧化功能。
6.本发明是通过以下技术方案予以实现的：
7.一种利用脉冲电场提高豌豆分离蛋白柔性的方法，该方法包括以下步骤：将豌豆分离蛋白与去离子水按照(1～10)g:100ml质量体积比例混合均匀，置于脉冲电场设备中，
固定频率、脉宽和流速，在一定电场强度下处理一定时间，将溶液冻干，得到脉冲电场预处理后的豌豆分离蛋白(p-ppi)。
8.优选地，频率500～2000hz，脉宽10～50μs，流速40～100rpm，电场强度为5～25kv/cm，更优选为10kv/cm，处理时间为0.5～2min，更优选为1min。
9.本发明还保护所述方法得到的脉冲电场预处理后的豌豆分离蛋白的应用，用于制备豌豆分离蛋白-儿茶素复合物，包括以下步骤：分别配制一定浓度的脉冲电场预处理后的豌豆分离蛋白(p-ppi)溶液和儿茶素溶液，调节ph，将脉冲电场预处理后的豌豆分离蛋白(p-ppi)溶液与儿茶素溶液按质量比为100:1～100:20混合，室温避光隔氧搅拌一定时间，将溶液透析，冻干，得到豌豆分离蛋白-儿茶素复合物；所述的儿茶素为表儿茶素(ec)、表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)和表没食子儿茶素没食子酸酯(ecgg)中的一种，更优选为表没食子儿茶素没食子酸酯(ecgg)。
10.优选的，脉冲电场预处理后的豌豆分离蛋白(p-ppi)溶液的浓度为1～10mg/ml，更优选为5mg/ml，儿茶素溶液的浓度为0.5～5mg/ml，更优选为1mg/ml。
11.优选的，豌豆分离蛋白(p-ppi)溶液与儿茶素溶液反应的ph为5～7，更优选为ph＝7，室温避光隔氧搅拌时间为1～4h，更优选为2h，磁力搅拌速度为200～600rpm。
12.优选的，透析袋规格为3500da，透析时间为48h，每6h更换一次水。
13.优选的，所述的冻干为真空冷冻干燥，预冻温度为-80℃，冷冻干燥的时间为48h。
14.本发明的有益效果如下：
15.(1)本发明采用脉冲电场预处理，具有作用时间短(2min之内)，作用条件温和(常温)的特点，同时能够显著提高豌豆分离蛋白的结构柔性，促进豌豆分离蛋白结构展开(α-螺旋含量减少了23.25％，无规则卷曲含量增加了117.25％)。
16.(2)本发明采用脉冲电场预处理豌豆分离蛋白，显著提高蛋白结合多酚的能力。在蛋白与儿茶素的质量比为10:1时，蛋白的儿茶素结合当量提高了30.10％。蛋白的一个亚基的多酚结合位点从4个增加到10个(提高了150％)。
17.(3)本发明制备的脉冲电场预处理的豌豆分离蛋白-儿茶素复合物，相比于未经过脉冲电场预处理的蛋白，在蛋白与儿茶素的质量比为20:1时，复合物的dpph和abts自由基清除力可达到91.07，988.79μmol te/g，分别提高了22.47％和50.40％。这些结果表明，本发明制备的豌豆分离蛋白-儿茶素复合物具有非常高的抗氧化能力，能够扩展豌豆分离蛋白的应用，解决豌豆分离蛋白功能性不佳的问题，同时提高儿茶素的有效利用率。
附图说明：
18.图1是豌豆分离蛋白在施加脉冲电场和未施加脉冲电场的分子动力学模拟结果，(a)为蛋白质的总溶剂可及表面积图，(b)为蛋白质的二级结构的含量图。
19.图2为分子动力学模拟后的豌豆分离蛋白与表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)的分子对接图，(a)为mp0与egcg的分子对接图，(b)为mp10与egcg的分子对接图。
具体实施方式：
20.以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
21.实施例1：
22.(1)将豌豆分离蛋白与去离子水按照1:100(g/ml)比例混合均匀，置于脉冲电场设备中，固定频率为1khz，脉宽为40μs，流速为50rpm，在电场强度为10kv/cm下处理1min，将溶液冻干。得到脉冲电场预处理的蛋白，标记为p-ppi。
23.(2)豌豆分离蛋白-egcg复合物的制备：配制5mg/ml的p-ppi溶液，1mg/ml的egcg溶液，调节ph至7.0，将蛋白溶液与egcg溶液按100:5混合，室温避光隔氧，400rpm磁力搅拌2h，将溶液透析48h，透析袋规格为3500da，每6h更换一次水，在-80℃冰箱预冻后，于真空冷冻干燥机中冻干48h，制得p-ppi-egcg复合物。
24.实施例2
25.(1)将豌豆分离蛋白与去离子水按照1:100(g/ml)比例混合均匀，置于脉冲电场设备中，固定频率为1khz，脉宽为40μs，流速为50rpm，在电场强度为10kv/cm下处理1min，将溶液冻干。得到脉冲电场预处理的蛋白，标记为p-ppi。
26.(2)豌豆分离蛋白-egcg复合物的制备：配制5mg/ml的p-ppi溶液，1mg/ml的egcg溶液，调节ph至7.0，将蛋白溶液与egcg溶液按100:10混合，室温避光隔氧，400rpm磁力搅拌2h，将溶液透析48h，透析袋规格为3500da，每6h更换一次水，在-80℃冰箱预冻后，于真空冷冻干燥机中冻干48h，制得p-ppi-egcg复合物。
27.实施例3
28.(1)将豌豆分离蛋白与去离子水按照1:100(g/ml)比例混合均匀，置于脉冲电场设备中，固定频率为1khz，脉宽为40μs，流速为50rpm，在电场强度为10kv/cm下处理1min，将溶液冻干。得到脉冲电场预处理的蛋白，标记为p-ppi。
29.(2)豌豆分离蛋白-egcg复合物的制备：配制5mg/ml的p-ppi溶液，1mg/ml的egcg溶液，调节ph至7.0，将蛋白溶液与egcg溶液按100:20混合，室温避光隔氧，400rpm磁力搅拌2h，将溶液透析48h，透析袋规格为3500da，每6h更换一次水，在-80℃冰箱预冻后，于真空冷冻干燥机中冻干48h，制得p-ppi-egcg复合物。
30.对比例1
31.豌豆分离蛋白-egcg复合物的制备：配制5mg/ml未经脉冲电场预处理的豌豆分离蛋白溶液(标记为n-ppi)，1mg/ml的egcg溶液，调节ph至7.0，将蛋白溶液与egcg溶液按100:5混合，室温避光隔氧，400rpm磁力搅拌2h，将溶液透析48h，透析袋规格为3500da，每6h更换一次水，在-80℃冰箱预冻后，于真空冷冻干燥机中冻干48h，制得n-ppi-egcg复合物。
32.对比例2
33.豌豆分离蛋白-egcg复合物的制备：配制5mg/ml未经脉冲电场预处理的豌豆分离蛋白溶液(标记为n-ppi)，1mg/ml的egcg溶液，调节ph至7.0，将蛋白溶液与egcg溶液按100:10混合，室温避光隔氧，400rpm磁力搅拌2h，将溶液透析48h，透析袋规格为3500da，每6h更换一次水，在-80℃冰箱预冻后，于真空冷冻干燥机中冻干48h，制得n-ppi-egcg复合物。
34.对比例3
35.豌豆分离蛋白-egcg复合物的制备配制5mg/ml未经脉冲电场预处理的豌豆分离蛋白溶液(标记为n-ppi)，1mg/ml的egcg溶液，调节ph至7.0，将蛋白溶液与egcg溶液按100:20混合，室温避光隔氧，400rpm磁力搅拌2h，将溶液透析48h，透析袋规格为3500da，每6h更换一次水，在-80℃冰箱预冻后，于真空冷冻干燥机中冻干48h，制得n-ppi-egcg复合物。
36.实施例4：性能和结构表征
egcg/g样品。
51.对上述实施例1～3和对比例1～3制备的豌豆分离蛋白-egcg复合物，进行多酚结合当量测定，其结果在表2列出。
52.表2实施例和对比例中p-ppi和n-ppi的egcg结合当量
[0053][0054]
表2中实施例1-3分别为p-ppi与egcg在质量比为100:5，100:10，100:20下反应得到的复合物，对比例1-3分别为n-ppi与egcg在相对应比例下反应得到的复合物。通过表2可以看出，在相同比例下，实施例中蛋白的egcg结合当量均比对比例显著增加，分别提高了15.13％，30.10％，8.24％。实施例的蛋白的有效结合率也显著增加，特别是在ppi与egcg的比例为100:10时。这些结果表明，脉冲电场预处理能够显著提高豌豆分离蛋白结合egcg的能力。
[0055]
四、蛋白质-多酚复合物抗氧化能力的测定方法：
[0056]
(1)dpph自由基清除率的测定：配制5mg/ml的复合物样品溶液和40μg/ml的dpph-乙醇溶液，取0.2ml样品溶液与4mldpph-乙醇溶液混合，避光反应30min，测定波长为517nm的吸光度。根据吸光值，dpph清除率由公式(1-1)计算。使用trolox作为标准对照物，测定结果表示为μmol trolox当量每克样品(μmol te/g)。
[0057][0058]
式中：a1为样品与dpph-乙醇混合溶液的吸光度；a2为样品溶液的吸光度；a0为dpph-乙醇溶液的吸光度。
[0059]
(2)abts自由基清除率的测定：配制abts母液(7mmol/labts和2.45mmol/l过硫酸钾溶液)，母液避光保存16h待用，使用前将母液稀释，在734nm下吸光度为0.70
±
0.02。配制1mg/ml的复合物样品溶液。将50μl的样品溶液与4ml稀释后的abts溶液混合，避光反应30min，测定波长为734nm的吸光度。根据吸光值，abts自由基清除率由公式(1-2)计算。使用trolox作为标准对照物，测定结果表示为μmol trolox当量每克样品(μmol te/g)。
[0060][0061]
式中：a1为样品与abts混合溶液的吸光度；a2为样品溶液的吸光度；a0为abts溶液的吸光度。
[0062]
对上述实施例1～3和对比例1～3制备的豌豆分离蛋白-egcg复合物，进行抗氧化能力测定，其结果在表3列出。
[0063]
表3实施例和对比例中豌豆分离蛋白-egcg复合物的抗氧化能力
[0064][0065]
经过测定，纯豌豆分离蛋白几乎不具备抗氧化能力。通过表3可以看出，在相同豌豆分离蛋白与egcg的比例下，实施例的dpph和abts自由基清除力均显著高于对比例。dpph自由基清除力分别提高了22.47％，16.77％和16.11％。abts自由基清除力分别提高了50.40％，24.78％和26.00％。这些结果表明，脉冲电场处理后的豌豆分离蛋白，与egcg结合后，具有显著增强的抗氧化能力。
[0066]
因此，本发明采用脉冲电场预处理豌豆分离蛋白，是非常高效、安全的处理手段，能够显著提高豌豆分离蛋白结合多酚的能力，从而显著增强其抗氧化能力。
[0067]
需要说明的是，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。