一种耐盐的RPK突变体及其应用的制作方法

一种耐盐的rpk突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种耐盐的rpk突变体及其应用。


背景技术：

2.蛋白酶k(pk)是一种非特异性蛋白内切酶，该酶属丝氨酸类蛋白酶，可以切割脂肪族氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸羧基端连接的酯键和肽键。分子量大小为29.3kda(单体)，在ph4到ph12的条件下均有活性，在sds、尿素或edta存在时亦很稳定。
3.蛋白酶k能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的降解。此酶经脱色和色谱纯化去除了rna和dna，也检测不到其它杂酶活性。由于蛋白酶k在尿素和sds中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，其水解的最小多肽是四肽分子。
4.然而，本发明人在发酵生产中发现，重组蛋白酶k(rpk)易发生聚集沉淀的问题，给实际生产过程带来问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种耐盐的rpk突变体及其应用。
6.在本发明的第一方面，提供一种蛋白酶k突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于seq id no:1所示的蛋白酶k，以下位点发生突变的酶：第266位、第279位；所述位点突变为亲水性或中性氨基酸。
7.在一个或多个实施方式中，所述的蛋白酶k突变体的第266位突变为tyr、第279位突变为gly。
8.在一个或多个实施方式中，所述的蛋白酶k突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示。
9.在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，其编码前一方面所述的蛋白酶k突变体。
10.在一个或多个实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:4所示。
11.在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
12.在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的的多核苷酸。
13.在一个或多个实施方式中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
14.在一个或多个实施方式中，所述真核细胞包括酵母细胞、霉菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞等。
15.在一个或多个实施方式中，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等。
16.在本发明的另一方面，提供一种提高蛋白酶k的耐盐性或稳定性的方法，包括对其进行突变改造，对应于seq id no:1所示的蛋白酶k，对选自下组的位点或位点组合进行突变：第266位、第279位；所述位点突变为亲水性或中性氨基酸。
17.在本发明的另一方面，提供前面任一所述的蛋白酶k突变体的制备方法，该方法包含：(i)培养所述的宿主细胞；(ii)收集含有所述的蛋白酶k突变体的培养物；(iii)从培养物中分离出所述的蛋白酶k突变体。
18.在本发明的另一方面，提供前面任一所述的蛋白酶k突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于酶解蛋白质；较佳地，其被用于特异性识别和切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，酶解蛋白质。
19.在本发明的另一方面，提供一种酶解蛋白质的方法，包括：利用前面任一所述的蛋白酶k突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行酶解反应。
20.在本发明的另一方面，提供一种用于酶解蛋白质的检测体系或检测试剂盒，其中含有：前面任一所述的蛋白酶k突变体，表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物。
21.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
22.图1、野生型rpk和rpk突变体突变体的三维结构对比。
23.图2、野生型rpk和rpk突变体分子表面疏水图。
24.图3、野生型rpk和rpk突变体原液稳定性对比。
具体实施方式
25.本发明人经过深入的研究试验，发现蛋白酶k的一些位点与其耐盐性及稳定性密切相关。在此基础上，本发明人获得了一种蛋白酶k突变体，与野生型相比，所述突变体的耐盐性及稳定性更好。本发明也提供了优化的表达重组蛋白酶k突变体的方法，其产量高、生产成本低、适合规模化生产。
26.术语
27.如本文所用，除非另外说明，所述的“蛋白酶k的突变体”、“突变型蛋白酶k”可互换使用，是指对应于野生型蛋白酶k(如seq id no:1)，发生选自以下位置的突变后所构成的蛋白：第266位、第279位。
28.如本文所用，除非另外说明，所述的“蛋白酶k的突变体”、“突变型蛋白酶k”可互换使用，是指对野生型的蛋白酶k进行突变后的产物。
29.如本文所用，若需要表示野生型的蛋白酶k，其将被标示为“野生型蛋白酶k”、seq id no:1所示氨基酸序列的蛋白或wt。
30.如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
31.如本文所用，“分离的蛋白酶k突变体”是指蛋白酶k突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化蛋白酶k突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
32.如本文所用，“重组的(recombinant；r)”是指借助基因工程手段来获得(或大量制
备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。
33.如本文所用，“提高耐盐性或稳定性”是指与改造前的野生型蛋白酶k相比，发生突变的蛋白酶k的耐盐性或稳定性发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种反应条件/环境下，耐盐性或稳定性提高的突变型蛋白酶k的耐盐性或稳定性比改造前的酶显著提高5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，50％以上，70％以上，80％以上，100％，150％以上等。
34.如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”。术语“基本上由
……
构成”指在组合物/反应体系/试剂盒中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。
35.如本文所用，术语“有效量”是指可对本发明感兴趣的反应产生功能或活性、达到预期效果(准确的检测结果)的量。
36.蛋白酶k突变体、其编码核酸及构建体
37.本发明的蛋白酶k突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
38.本发明还包括所述蛋白酶k突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然蛋白酶k突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，需要满足的条件是：所述的蛋白酶k突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在至少一种本发明上面所特别指出的突变，较佳地，该突变为对应于seq id no:1所示的氨基酸序列，包括第266位突变为tyr、第279位突变为gly。
39.在本发明中，术语“蛋白酶k突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括蛋白酶k突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于seq id no:1所示的氨基酸序列，包括第266位突变为tyr、第279位突变为gly。
40.在本发明中，术语“蛋白酶k突变体”还包括(但并不限于)：与所述的蛋白酶k突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于seq id no:1所示的氨基酸序列，包括第266位突变为tyr、第279位突变为gly。
41.发明还提供所述蛋白酶k突变体的类似物。这些类似物与所述蛋白酶k突变体的差
别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
42.本发明还提供了编码本发明蛋白酶k突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。
43.本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
44.编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
[0045]“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0046]
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白酶k突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述突变的酶的方法。
[0047]
通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的蛋白酶k突变体。一般来说有以下步骤：
[0048]
(1).用本发明的编码蛋白酶k突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0049]
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0050]
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0051]
本发明中，蛋白酶k突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0052]
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含蛋白酶k突变体编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
[0053]
包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适
当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0054]
本发明中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如霉菌细胞，酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的具体实施例中，以酵母细胞作为宿主细胞。
[0055]
本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
[0056]
突变体的重组表达
[0057]
本发明建立的重组细胞(宿主细胞)可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0058]
在表达时，本发明的蛋白酶k突变体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高速离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0059]
本发明的重组表达蛋白酶k突变体的方法，解决了现有技术中重组蛋白酶k稳定性偏低、耐盐性不理想、容易产生沉淀的问题。
[0060]
重组蛋白酶k的应用
[0061]
rpk利用毕赤酵母发酵获得，而毕赤酵母的发酵使用的培养基为约为1m高浓度的磷酸盐和硫酸盐，而且是在ph5.0的酸性条件下。rpk在该高盐培养基的稳定性成为rpk发酵成功的关键。
[0062]
毕赤酵母表达的rpk在较高的盐浓度中极易发生沉淀，其可能的原因是rpk在较高的离子强度及杂蛋白下易发生聚集或共沉淀，而且蛋白浓度越高沉淀越明显。因此rpk易发生聚集沉淀的问题给实际生产过程带来问题。现有技术中的rpk或其改造的多肽尚没有解决高盐浓度下的这一问题。本发明人分析了野生型rpk的分子结构，找出了易发生聚集沉淀的原因，对蛋白质一级结构进行定向改造，提高其溶液稳定性。本发明解决了现有的重组蛋白酶k的表达、纯化中耐盐性低、稳定性低等问题。
[0063]
本发明的改造的蛋白酶k突变体有多方面的与蛋白酶k特性相关的用途，包括但不限于：特异性识别和切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，酶解蛋白质或者变性蛋白质。
[0064]
作为一种实施方式，所述的蛋白酶k突变体可应用于基因组dna抽提、酶的消化去除。
[0065]
作为一种实施方式，所述的蛋白酶k突变体可应用于制备脉冲电泳的染色体dna，蛋白质印迹以及去除dna和rna制备中的核酸酶等
[0066]
作为一种实施方式，所述的蛋白酶k突变体在原位杂交技术中可用于杂交前的处理，它具有消化包围靶dna蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。
[0067]
作为一些工业方面的实施方式，所述的蛋白酶k突变体可应用在皮革、毛皮、丝绸、
医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，具有省时便捷的特点。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用弹性蛋白酶治疗脉管炎以及用蛋白酶k、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物。
[0068]
本发明的蛋白酶k突变体具有产量高、稳定性好、酶活高、成本低、适合大规模工业生产的优点。同时，本发明的蛋白酶k突变体可以被长期储存，符合工业生产所需。
[0069]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0070]
实施例1、野生型蛋白酶k(pk)的重组发酵
[0071]
野生型的蛋白酶k(pk)的氨基酸序列如下(seq id no:1)：
[0072]
aaqtnapwglarisstspgtstyyydesagqgscvyvidtgieashpefegraqmvktyyyssrdgnghgthcagtvgsrtygvakktqlfgvkvlddngsgqystiiagmdfvasdknnrncpkgvvaslslgggysssvnsaaarlqssgvmvavaagnnnadarnyspasepsvctvgasdrydrrssfsnygsvldifgpgtsilstwiggstrsisgtsmatphvaglaaylmtlgkttaasacryiadtankgdlsnipfgtvnllaynnyqa
[0073]
上述野生型的蛋白酶k(pk)的编码序列如下(seq id no:3)：
[0074]
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[0075]
将上述编码序列插入到质粒ppic9k并重组整合至毕赤酵母gs115。
[0076]
发酵液：85％h3po
4 26.7ml/l，koh 4.13g/l，甘油40g/l，k2so
4 18.2g/l，caso
4 0.93g/l，mgso4·
7h2o 14.9g/l，盐浓度约1m。
[0077]
发酵方法(包括发酵条件)：整个发酵分为甘油分批发酵、甘油补料发酵和甲醇诱导发酵三个阶段。在甘油分批发酵中，由于菌浓较低发酵液中维持较高的溶氧水平。随着菌浓的增大，do开始逐渐降低至培养基中的甘油代谢完全，甘油的耗尽将导致菌体生长减缓，do呈现急剧上升趋势。诱导表达阶段的开始始于菌浓od600达到较高值时，进行甲醇诱导表达。其中发酵的调控主要依据溶氧参数的变化，维持在20-30％。
[0078]
监控发酵进程，本发明人发现，毕赤酵母表达的重组蛋白酶k(rpk)在较高的盐浓
度(盐浓度约1m或高于1m)中极易发生沉淀，可能的原因是rpk在较高的离子强度下蛋白浓度较高时易发生聚集或共沉淀。而且，随着发酵进程的继续，蛋白浓度越高时，可观察到的沉淀越来越明显。由于沉淀的大量产生，严重影响了活性rpk蛋白的产量。
[0079]
因此，在发酵生产中，rpk易发生聚集沉淀的问题，给实际生产过程带来问题。
[0080]
实施例2、rpk蛋白的优化改造
[0081]
在野生型的蛋白酶k(pk)的基础上，本发明人分析了其三维结构、表面亲疏水性、氨基酸溶剂可及性等。
[0082]
结果反复研究分析，本发明人将改造位置定位于phe266和ala279，它们位于蛋白三维结构的表面并且为疏水性氨基酸，它们促成了在蛋白浓度及离子强度较高的条件下易发生聚集沉淀，导致rpk酶原液沉淀，进而使蛋白浓度降低。
[0083]
本发明人采用定点突变的方法将其修改为侧链基团结构相似的亲水性和中性氨基酸，从而降低此位点的疏水性。经氨基酸分析phe266突变为tyr，tyr与phe相比其r基侧链上多了一个羟基为亲水基团，ala279突变为gly其r基上疏水性甲基变为氢原子其疏水性降低。
[0084]
如图1，比较野生型rpk(左图)和rpk突变体突变体(右图)，图中第266和279位氨基酸残基用已被标注。野生型rpk中散布的星号示意为水分子，由于phe266和ala279在分子表面并且疏水性较强，因此其周围水分子较少并距离较远。右图为rpk突变体突变体模拟的三维结构，因此周围没有显示水分子。pk突变体第266位氨基酸残基变为tyr，侧链苯环增加亲水性的羟基，因此其亲水性增加。第279位ala突变为gly其疏水性液降低。
[0085]
如图2，本发明人分析了野生型rpk(左图)和rpk突变体(右图)的分子表面疏水情况，图中蓝色代表亲水区域，红色代表疏水区域，白色代表中性区域。图中第226和279位氨基酸残基在分子表面的区域用黑色椭圆和氨基酸编号标出。从两者的对比可知rpk突变体在266和279位氨基酸残基处呈现较强的疏水性，右图rpk突变体在266为tyr变为亲水性集团，266位氨基酸由疏水性区域变为中性区域，因此rpk突变体表面疏水区域减少将使其在水溶液中发生聚集沉淀等不稳定现象得到缓解。
[0086]
根据上述改造方案，突变后的氨基酸序列如下(seq id no:2)：
[0087]
aaqtnapwglarisstspgtstyyydesagqgscvyvidtgieashpefegraqmvktyyyssrdgnghgthcagtvgsrtygvakktqlfgvkvlddngsgqystiiagmdfvasdknnrncpkgvvaslslgggysssvnsaaarlqssgvmvavaagnnnadarnyspasepsvctvgasdrydrrssfsnygsvldifgpgtsilstwiggstrsisgtsmatphvaglaaylmtlgkttaasacryiadtankgdlsnipygtvnllaynnyqg
[0088]
上述突变型的蛋白酶k(pk)的编码序列如下(seq id no:4)：
[0089]
gcggcgcagaccaacgcgccgtggggcctggcgcgcattagcagcaccagcccgggcaccagcacctattattatgatgaaagcgcgggccagggcagctgcgtgtatgtgattgataccggcattgaagcgagccatccggaatttgaaggccgcgcgcagatggtgaaaacctattattatagcagccgcgatggcaacggccatggcacccattgcgcgggcaccgtgggcagccgcacctatggcgtggcgaaaaaaacccagctgtttggcgtgaaagtgctggatgataacggcagcggccagtatagcaccattattgcgggcatggattttgtggcgagcgataaaaacaaccgcaactgcccgaaaggcgtggtggcgagcctgagcctgggcggcggctatagcagcagcgtgaacagcgcggcggcgcgcctgcagagcagcggcgtgatggtggcggtggcggcgggcaacaacaacgcggatgcgcgcaactatagcccggcgagcgaaccgagcgtgtgcaccgtgggcgcgagcgatcgctatgatcgccgcagcagctttagcaactatggcagcgtgctggat
atttttggcccgggcaccagcattctgagcacctggattggcggcagcacccgcagcattagcggcaccagcatggcgaccccgcatgtggcgggcctggcggcgtatctgatgaccctgggcaaaaccaccgcggcgagcgcgtgccgctatattgcggataccgcgaacaaaggcgatctgagcaacattccgtatggcaccgtgaacctgctggcgtataacaactatcagggc
[0090]
采用如实施例1中同样的方法，本发明人将上述改造的酶的编码序列引入到毕赤酵母表达载体中，转化毕赤酵母。
[0091]
采用如实施例1中同样的发酵方法，本发明人利用该重组毕赤进行发酵，表达突变型的蛋白酶k。
[0092]
监控发酵进程，本发明人发现，毕赤酵母表达的突变型的重组蛋白酶k(rpk)在较高的盐浓度(盐浓度约1m或高于1m)中不易发生沉淀，没有观察到明显的聚集或共沉淀。
[0093]
实施例3、突变前后rpk原液稳定性对比
[0094]
采用实施例1的发酵方法进行发酵，本发明人定量统计和比较了野生型以及突变体的rpk的活性蛋白的发酵液活性。
[0095]
甲醇诱导后72小时，进行发酵液活性测定，测定方法为：以酪蛋白为底物。活性定义：在37℃ph 7.5条件下，每分钟可水解酪蛋白底物生成1μmol l-酪氨酸的蛋白酶k的量定义为一个单位(u)。
[0096]
发酵液活性的比较结果如表1。
[0097]
表1、发酵液活性
[0098][0099]
根据表1所示，野生型rpk在发酵液的高盐环境下，在发酵过程中即会产生沉淀，因此发酵液活性只能达到530u/ml。与此相比，rpk突变体发酵液活性即可达到716u/ml。
[0100]
因此，rpk突变体具有良好的耐盐性能。
[0101]
实施例4、突变前后rpk纯化过程比较及回收率比较
[0102]
采用实施例1的发酵方法进行发酵，本发明人定量统计和比较了野生型以及突变体的rpk的活性蛋白的回收率。
[0103]
在发酵至72小时后终止发酵，取发酵上清进行纯化。
[0104]
纯化方法包括：先对发酵液进行微滤，收集上清，上清进行超滤并换液到低浓度0.1m tris-hcl缓冲液中，直接上镍柱纯化，咪唑洗脱，收集活性峰，测活后合并。
[0105]
在纯化过程中以及纯化后，活性蛋白的存在情况如表2。
[0106]
表2
[0107][0108]
结果发现，野生型rpk在微滤及超滤过程中存在46％的活性损失，最终镍柱纯化后活性只能达到发酵液总活性的45％。与之相比，突变型rpk在微滤和超滤过程活性损失减少，活性回收90％，进一步经镍柱纯化最终rpk突变体活性回收为85％。
[0109]
对比纯化后原液的比活两者相近，说明突变体没有改变其催化特性。
[0110]
实施例5、突变前后原液稳定性对比
[0111]
采用实施例1的发酵方法进行发酵，生产野生型rpk和rpk突变体，并获得其纯化浓缩后原液(如实施例3)，比较野生型以及突变体的rpk的稳定性。
[0112]
将蛋白浓度浓缩至30mg/ml，分别取野生型rpk和rpk突变体原液1ml(每组三平行)，放置于25℃室温中，分别在第0、6、12、24、48h进行活性测定，计算三组的平均活性，以0h原液活性为100％计算各个点活性的残余率，将活性和时间的关系进行作图。
[0113]
结果如图3所示，野生型rpk在放置的过程中活性不断降低，观察离心管底部下面逐渐产生聚集形成的沉淀，沉淀逐渐增多，第48h活性残余68％。与此对比，本发明优化的rpk突变体放置过程活性较稳定，几乎不出现沉淀，第48h活性残余为93％。
[0114]
结论
[0115]
突变体提高了rpk的溶解稳定性，在生产过程中显示发酵液活性升高，整个生产及纯化过程回收率增加，对原液放置稳定性进行比较，rpk突变体原液在放置过程中没有出现明显的沉淀，溶液活性几乎不降低。
[0116]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。