用于生产肝素原的方法和具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌与流程

1.本发明涉及通过使用埃希氏杆菌属(escherichia)细菌的发酵生产来生产作为埃希氏杆菌属细菌的一种荚膜多糖的n-乙酰肝素原(在后文中被称为肝素原(heparosan))的方法。


背景技术：

2.作为一种硫酸化多糖的肝素是一种抗凝剂，被用于治疗血栓栓塞和弥散性血管内凝血综合征，以及在人工透析期间和体外循环中预防凝血等。在工业上，使用的肝素大部分从猪的肠黏膜提取并纯化。
3.自2008年因猪源性肝素被杂质污染而造成的致死事故以来，要求研究和开发非动物来源的生产受控且质量受控的肝素。作为一个具体实例，在一种方法中对发酵生产和纯化的作为革兰氏阴性微生物的一种荚膜多糖的n-乙酰肝素原进行化学n-脱乙酰化和n-硫酸化，然后进行酶促差向异构化和硫酸化，以产生具有与源自于猪的肝素相同的结构和抗凝活性的肝素(npl 1和2)。
4.在上述方法中，作为基本结构的肝素原是由葡萄糖醛酸(glca)和n-乙酰-d-葡萄糖胺(glcnac)的重复二糖结构组成的糖链。为了生产肝素原，已报道了使用原本具有肝素原生产能力的大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)k5菌株的方法(ptl 1和npl 1)、使用也具有肝素原生产能力的大肠埃希氏杆菌nissle 1917菌株的方法(npl 2)和使用原本不具有肝素原生产能力的大肠埃希氏杆菌的方法(ptl 4和npl 3和4)。
5.肝素原被分类为2类荚膜多糖，并且已知在大肠埃希氏杆菌k5菌株中，在基因组上形成簇的i区、ii区和iii区的基因群参与肝素原的合成和运输(npl 4)。
6.据称，在由这些基因群编码的蛋白质中，kpss和kpsc允许将多个3-脱氧-d-甘露-辛酮糖酸(kdo)残基转移到内膜中的磷脂酰甘油上，并且糖基转移酶kfia和kfic添加前体糖核苷酸，从而进行肝素原的合成(npl 5和6)。
7.此外，kfid参与前体udp-glca的合成；kpsf和kpsu参与作为kdo连接物合成的底物的cmp-kdo的合成；并且kpsm、kpst、kpse和kpsd参与在内膜上合成的肝素原向细菌细胞外部的运输(npl 6)。
8.作为使用不具有肝素原生产能力的大肠埃希氏杆菌bl21菌株和k-12菌株作为宿主进行肝素原发酵的方法，已知一种将源自于大肠埃希氏杆菌k5菌株的ii区的kfiabcd基因簇引入到所述宿主中的方法。此外，已报道了提高肝素原生产的基因，例如rfah、nusg和rpoe(ptl4和npl 3和4)。
9.[引文表]
[0010]
[专利文献]
[0011]
[ptl 1]日本专利号5830464
[0012]
[ptl 2]美国专利号8771995
[0013]
[ptl 3]wo2018/048973
[0014]
[ptl 4]美国专利号9975928
[0015]
[非专利文献]
[0016]
[npl 1]biotechnology and bioengineering 107(2010)964-973
[0017]
[npl 2]applied microbiology and biotechnology 103(2019)6771-6782
[0018]
[npl 3]metabolic engineering 14(2012)521-527
[0019]
[npl 4]carbohydrate research 360(2012)19-24
[0020]
[npl 5]proceedings of the national academy of sciences of usa 110(2013)20753-20758
[0021]
[npl 6]carbohydrate research 378(2013)35-44


技术实现要素：

[0022]
[技术问题]
[0023]
如上所述，已对非动物来源的生产受控且质量受控的肝素的生产进行了研究和开发，但传统生产方法在效率上不足。同时，由i、ii和iii区编码的各个基因如何影响具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌的肝素原生产，到目前为止尚不知道。
[0024]
因此，本发明的目的是提供一种通过具有生产肝素原的能力的埃希氏杆菌属细菌的遗传修饰来提高生产肝素原的效率的高效生产肝素原的方法。
[0025]
[技术解决方案]
[0026]
本发明的发明人发现，通过使用具有特定遗传修饰并具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌，肝素原的生产效率得以提高，并因此完成了本发明。
[0027]
也就是说，本发明如下所述。
[0028]
1.一种用于生产肝素原的方法，所述方法包括：
[0029]
将具有下述遗传修饰(1)并具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌在培养基中培养，以在所述培养基中生产肝素原：
[0030]
(1)提高kpss基因的表达的遗传修饰。
[0031]
2.根据1所述的用于生产肝素原的方法，其中所述埃希氏杆菌属细菌还具有下述遗传修饰(2)和(3)中的至少一者：
[0032]
(2)提高选自kfia基因、kfib基因、kfic基因和kfid基因的至少一个基因的表达的遗传修饰，和
[0033]
(3)引起yhbj基因的功能丧失的遗传修饰。
[0034]
3.根据1或2所述的用于生产肝素原的方法，其中所述遗传修饰(1)是修饰kpss基因的表达控制区和提高kpss基因的拷贝数中的至少一者。
[0035]
4.根据2或3所述的用于生产肝素原的方法，其中所述遗传修饰(2)是修饰选自kfia基因、kfib基因、kfic基因和kfid基因的至少一个基因的表达控制区和提高选自kfia基因、kfib基因、kfic基因和kfid基因的至少一个基因的拷贝数中的至少一者。
[0036]
5.根据2至4中的任一项所述的用于生产肝素原的方法，其中所述遗传修饰(3)是yhbj基因的缺失。
[0037]
6.根据1至5中的任一项所述的用于生产肝素原的方法，其中所述埃希氏杆菌属细
菌是大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)。
[0038]
7.根据1至6中的任一项所述的用于生产肝素原的方法，其中所述kpss基因是包含seq id no：33中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：33中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平提高时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性。
[0039]
8.根据2至7中的任一项所述的用于生产肝素原的方法，其中
[0040]
所述kfia基因是包含seq id no：34中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：34中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平提高时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性，
[0041]
所述kfib基因是包含seq id no：35中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：35中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平提高时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性，
[0042]
所述kfic基因是包含seq id no：36中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：36中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平提高时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性，并且
[0043]
所述kfid基因是包含seq id no：37中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：37中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平提高时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性。
[0044]
9.根据2至8中的任一项所述的用于生产肝素原的方法，其中所述yhbj基因是包含seq id no：38中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：38中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平降低时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性。
[0045]
10.根据1至9中的任一项所述的用于生产肝素原的方法，其中所述埃希氏杆菌属细菌不具有下述遗传修饰(4)：
[0046]
(4)提高kpsc基因的表达的遗传修饰。
[0047]
11.一种埃希氏杆菌属细菌，其具有肝素原生产能力并具有下述遗传修饰(1)：
[0048]
(1)提高kpss基因的表达的遗传修饰。
[0049]
12.根据11所述的埃希氏杆菌属细菌，其还具有下述遗传修饰(2)和(3)中的至少一者：
[0050]
(2)提高选自kfia基因、kfib基因、kfic基因和kfid基因的至少一个基因的表达的遗传修饰，和
[0051]
(3)引起yhbj基因的功能丧失的遗传修饰。
[0052]
13.根据11或12所述的埃希氏杆菌属细菌，其不具有下述遗传修饰(4)：
[0053]
(4)提高kpsc基因的表达的遗传修饰。
[0054]
[有利效果]
[0055]
根据本发明的用于生产肝素原的方法，通过使用具有特定遗传修饰并具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌，可以以出色的生产效率生产非动物来源的肝素原。
附图说明
[0056]
[图1]图1示出了大肠埃希氏杆菌k5菌株的染色体上肝素原合成基因簇的示意图。
[0057]
[图2]图2示出了参与肝素原生产的酶的示意图。
[0058]
[图3]图3示出了肝素原生物合成途径的示意图。
具体实施方式
[0059]
在后文中，除非另有说明，否则在本说明书中使用的术语具有在本领域中常用的含义。
[0060]
《本发明的细菌》
[0061]
在本发明的用于生产肝素原的方法中，使用了具有下述遗传修饰(1)并具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌(在后文中简称为本发明的细菌)：
[0062]
(1)提高kpss基因的表达的遗传修饰。
[0063]
本发明的细菌优选地还具有下述遗传修饰(2)和(3)中的至少一者：
[0064]
(2)提高选自kfia基因、kfib基因、kfic基因和kfid基因的至少一个基因的表达的遗传修饰，和
[0065]
(3)引起yhbj基因的功能丧失的遗传修饰。
[0066]
因此，所述埃希氏杆菌属细菌中的遗传修饰的实例包括上述(1)和(2)、上述(1)和(3)以及上述(1)至(3)。
[0067]
本发明的细菌优选地不具有下述遗传修饰(4)：
[0068]
(4)提高kpsc基因的表达的遗传修饰。
[0069]
作为埃希氏杆菌属细菌的实例，图1示出了大肠埃希氏杆菌k5菌株的染色体上的肝素原合成基因簇的示意图[j.nzakizwanayo等，plos one(2015)]。此外，图2示出了参与肝素原生产的酶的示意图。
[0070]
如图1中所示，kpss和kpsc是i区、ii区和iii区的基因群中由i区编码的基因。如图2中所示，kpss和kpsc参与肝素原合成的起始。在肝素原生产中，kpss与kpsc一起在向内膜中的磷脂酰甘油添加多个kdo连接物中发挥作用。
[0071]
作为kpss基因，源自于埃希氏杆菌属的kpss基因是优选的。其具体实例包括大肠埃希氏杆菌k5菌株的kpss基因。大肠埃希氏杆菌k5菌株的kpss基因的核苷酸序列和由所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列可以从公共数据库获得。大肠埃希氏杆菌k5菌株的kpss基因被登记为genbank登记号caa52659.1。
[0072]
kpss基因的实例包括包含seq id no：33中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：33中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平提高时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性。
[0073]
如图1中所示，kfia、kfib、kfic和kfid是i区、ii区和iii区的基因群中由ii区编码的基因。如图2中所示，kfia、kfib、kfic和kfid参与肝素原的合成，并发挥添加糖并由此合
成肝素原的作用。
[0074]
作为kfia、kfib、kfic或kfid基因，源自于埃希氏杆菌属的kfia、kfib、kfic或kfid基因是优选的。其具体实例包括大肠埃希氏杆菌k5菌株的kfia、kfib、kfic或kfid基因。大肠埃希氏杆菌k5菌株的kfia、kfib、kfic或kfid基因的核苷酸序列和由所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列可以从公共数据库获得。所述kfia被登记为genbank登记号caa54711.1；所述kfib被登记为genbank登记号cae55824.1；所述kfic被登记为genbank登记号caa54709.1；并且所述kfid被登记为genbank登记号caa54708.1。
[0075]
kfia基因的实例包括包含seq id no：34中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：34中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平提高时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性。
[0076]
kfib基因的实例包括包含seq id no：35中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：35中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平提高时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性。
[0077]
kfic基因的实例包括包含seq id no：36中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：36中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平提高时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性。
[0078]
kfid基因的实例包括包含seq id no：37中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：37中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平提高时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性。
[0079]
图3示出了肝素原生物合成途径的示意图。如图3中所示，glms是作为肝素原前体的udp-n-乙酰葡萄糖胺的供应途径中的第一个酶，并且是催化从果糖-6-磷酸到葡萄糖胺-6-磷酸的反应的酶。yhbj是负向控制glms的酶。
[0080]
作为yhbj基因，源自于埃希氏杆菌属的yhbj基因是优选的。其具体实例包括大肠埃希氏杆菌k-12菌株的yhbj基因。大肠埃希氏杆菌k-12菌株的yhbj基因的核苷酸序列和由所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列可以从公共数据库获得。大肠埃希氏杆菌k-12菌株的yhbj基因被登记为genbank登记号bae77249.1。
[0081]
yhbj基因的实例包括包含seq id no：38中示出的核苷酸序列的dna或包含与seq id no：38中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列的dna，并具有当在具有肝素原生产能力的埃希氏杆菌属细菌中表达水平降低时提高所述细菌的肝素原生产能力的特性。
[0082]
上述(1)至(3)中的各个基因可以从公共数据库，通过例如使用上述各个基因的核苷酸序列进行blast搜索或fasta搜索容易地获得。此外，各个基因的同源物可以使用微生物例如细菌的染色体作为模板并使用在这些已知基因序列的基础上产生的寡核苷酸作为引物，通过例如pcr来获得。
[0083]
上述(1)至(3)中的各个基因可以是所述基因的变体，只要由所述基因编码的蛋白
质的原始功能(例如活性或性质)得以维持即可。可以检查由所述基因的变体编码的蛋白质是否维持其原始功能；具体来说，例如当所述原始功能是提高肝素原生产能力时，通过将所述基因的变体引入到具有肝素原生产能力的属于原核生物的微生物中。
[0084]
上述(1)至(3)中的各个基因的变体可以根据定点突变方法，通过修饰基因的编码区使得在编码蛋白质的特定位置处的氨基酸残基被替换、缺失、插入或添加来获得。此外，上述(1)至(3)中的各个基因的变体也可以通过例如突变处理来获得。
[0085]
只要它们的原始功能得以维持，上述(1)至(3)中的各个基因可以是具有其中一个或几个位置处的一个或几个氨基酸被替换、缺失、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质的编码基因。例如，在编码的蛋白质中，其n-端和/或c-端可以被延长或缩短。短语“一个或几个”根据蛋白质的三维结构中氨基酸残基的位置和类型而不同。其具体实例包括1至50个、1至40个、1至30个，并且它优选为1至20个，更优选为1至10个，甚至更优选为1至5个，特别优选为1至3个。
[0086]
如上所述的一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入或添加是维持蛋白质功能正常的保守突变。保守突变的代表是保守替换。保守替换是下述突变：在替换位点是芳香族氨基酸的情况下，发生在phe、trp和tyr之间的替换；在替换位点是疏水氨基酸的情况下，发生在leu、ile和val之间的替换；在替换位点是极性氨基酸的情况下，发生在gln和asn之间的替换；在替换位点是碱性氨基酸的情况下，发生在lys、arg和his之间的替换；在替换位点是酸性氨基酸的情况下，发生在asp和glu之间的替换；以及在替换位点是具有羟基的氨基酸的情况下，发生在ser和thr之间的替换。被认为是保守替换的替换的具体实例包括用ser或thr替换ala，用gln、his或lys替换arg，用glu、gln、lys、his或asp替换asn，用asn、glu或gln替换asp，用ser或ala替换cys，用asn、glu、lys、his、asp或arg替换gln，用gly、asn、gln、lys或asp替换glu，用pro替换gly，用asn、lys、gln、arg或tyr替换his，用leu、met、val或phe替换ile，用ile、met、val或phe替换leu，用asn、glu、gln、his或arg替换lys，用ile、leu、val或phe替换met，用trp、tyr、met、ile或leu替换phe，用thr或ala替换ser，用ser或ala替换thr，用phe或tyr替换trp，用his、phe或trp替换tyr，以及用met、ile或leu替换val。此外，如上所述的氨基酸替换、缺失、插入、添加及其倒置等，包括由天然存在的突变(突变体或变体)例如基于基因所源自的生物体中的个体差异或种差异的突变所导致的替换、缺失、插入和添加、倒置等。
[0087]
此外，只要它们的原始功能得以维持，上述(1)至(3)中的各个基因可以是与所述整个氨基酸序列具有80％或更高、优选地90％或更高、更优选地95％或更高、甚至更优选地97％或更高、特别优选地99％或更高同一性的蛋白质的编码基因。
[0088]
此外，只要它们的原始功能得以维持，上述(1)至(3)中的各个基因可以是在严紧条件下与可以从已知基因序列制备的探针、例如与整个或一部分所述核苷酸序列互补的序列杂交的dna。术语“严紧条件”是指形成所谓的特异性杂交并且不形成非特异性杂交的条件。其实例包括彼此具有较高水平同一性的dna，例如彼此具有80％或更高、优选地90％或更高、更优选地95％或更高、甚至更优选地97％或更高、特别优选地99％或更高同一性的dna彼此杂交，并且彼此具有较低水平同一性的dna彼此不杂交的条件；或在正常southern杂交中用于清洗的条件，其中清洗在对应于60℃、1x ssc和0.1％sds，优选地60℃、0.1x ssc和0.1％sds，更优选地68℃、0.1x ssc和0.1％sds的盐浓度和温度下进行一次，优选地
两次到三次。
[0089]
用于上述杂交的探针可以是各个基因的互补序列的一部分。这种探针可以使用基于已知基因序列产生的寡核苷酸作为引物并使用含有上述(1)至(3)中的各个基因的dna片段作为模板，通过pcr来产生。例如，具有约300bp的长度的dna片段可以用作探针。在使用具有约300bp的长度的dna片段作为探针的情况下，在杂交中用于清洗的条件的实例包括50℃、2x ssc和0.1％sds的条件。
[0090]
此外，由于密码子简并性取决于宿主有所不同，因此上述(1)至(3)中的各个基因可以是通过将任何密码子用等同密码子替换而获得的基因，只要它们的原始功能得以维持即可。例如，表1至3中的基因可以被修饰，使得它们根据所使用的宿主的密码子使用频率而具有最佳密码子。
[0091]
突变处理的实例包括：用羟胺等体外处理具有上述(1)至(3)中的各个基因的核苷酸序列的dna分子的方法；用x-射线、紫外线或诱变剂例如n-甲基-n
’‑
硝基-n-亚硝基胍(ntg)、甲磺酸乙酯(ems)和甲磺酸甲酯(mms)等处理带有上述(1)至(3)中的各个基因的微生物的方法。
[0092]
《《提高基因表达水平的遗传修饰》》
[0093]
短语“基因表达的提高”意味着与未修饰的菌株相比基因的表达提高。提高基因表达的一种情况的实例包括其中与未修饰的菌株相比基因的表达优选地提高1.5倍或更多，更优选地提高2倍或更多，甚至更优选地提高3倍或更多的情况。
[0094]
此外，短语“基因表达被提高”不仅意味着在原本表达靶基因的菌株中所述靶基因表达的提高，而且意味着在原本不表达靶基因的菌株中所述靶基因被表达。也就是说，短语“基因表达被提高”包括例如将靶基因引入到不具有所述靶基因的菌株中并在其中表达所述靶基因的情况。此外，短语“基因表达被提高”也指短语“基因表达被增强”和“基因表达被升高”。
[0095]
基因表达的提高可以通过例如增加所述基因的拷贝数来实现。增加基因的拷贝数可以通过将所述基因引入到宿主的染色体中来实现。基因在染色体中的引入可以使用例如同源重组来进行(miller i,j.h.《分子遗传学实验》(experiments in molecular genetics)，1972，cold spring harbor laboratory)。可以引入基因的仅仅一个拷贝，或者可以引入其两个或更多个拷贝。
[0096]
例如，可以通过靶向在染色体上具有多个拷贝的序列进行同源重组，将基因的多个拷贝引入到染色体中。在染色体上具有多个拷贝的序列的实例包括重复dna序列(重复dna)和存在于转座子的两个末端处的反向重复序列。
[0097]
或者，同源重组可以靶向染色体上的适合序列例如对靶物质的生产来说非必需的基因来进行。同源重组可以通过例如使用线性dna的方法、使用含有温度敏感性复制原点的质粒的方法、使用能够接合转移的质粒的方法、使用不具有在宿主中起作用的复制原点的自杀质粒的方法或使用噬菌体的转导方法来进行。此外，也可以使用转座子或mini-mu将基因随机引入到染色体中(jp-a-h2-109985)。
[0098]
可以通过使用具有与所述基因的全部或一部分互补的序列的探针的southern杂交，使用在所述基因的序列的基础上产生的引物的pcr等，来检查靶基因是否已被引入到染色体中。
[0099]
此外，也可以通过将含有基因的载体引入到宿主中，来增加所述基因的拷贝数。例如，可以通过将含有靶基因的dna片段连接到在宿主中起作用的载体以构建所述基因的表达载体，并用所述表达载体转化所述宿主，来增加所述基因的拷贝数。通过例如使用具有靶基因的微生物的基因组dna作为模板的pcr，可以获得含有所述靶基因的dna片段。转化方法没有特别限制，并且可以使用常规已知的方法。
[0100]
作为载体，可以使用可以在宿主细胞中自主复制的载体。所述载体优选为多拷贝载体。此外，所述载体优选地具有标志物例如抗生素抗性基因或文献中描述的其他基因[karl friehs，“质粒拷贝数和质粒稳定性”(plasmid copy number and plasmid stability)，adv biochem engin/biotechnol 86:47-82(2004)]，以便选择转化体。此外，所述载体可以具有启动子或终止子，以便表达插入的基因。所述载体的实例包括源自于细菌质粒的载体、源自于酵母质粒的载体、源自于噬菌体的载体、粘粒、噬菌粒等。
[0101]
能够在肠杆菌科细菌例如大肠埃希氏杆菌中自主复制的载体的具体实例包括puc19、puc18、phsg299、phsg399、phsg398、pbr322和pstv29(都来自于takara bio inc.)、pacyc184、pmw219、pmw118和pmw119(都来自于nippon gene)、ptrc99a(pharmacia)、pprok载体(clontech)、pkk233-2(clontech)、pet载体(novagen)、pqe载体(qiagen)和广宿主范围载体rsf1010。
[0102]
在引入基因的情况下，所述基因保留在具有本发明的遗传修饰的埃希氏杆菌属细菌中就已足够。具体来说，所述基因被引入，使得它在本发明的细菌中起作用的启动子序列的控制下表达就已足够。启动子可以是源自于宿主的启动子或异源启动子。所述启动子可以是待引入基因的固有启动子或其他基因的启动子。作为启动子，可以使用例如后文中描述的较强启动子。
[0103]
用于终止转录的终止子可以被配置在基因的下游。对终止子没有特别限制，只要它在本发明的细菌中起作用即可。所述终止子可以是源自于宿主的终止子或异源终止子。所述终止子可以是特异性针对待引入基因的终止子，或者可以是其他基因的终止子。终止子的具体实例包括t7终止子、t4终止子、fd噬菌体终止子、tet终止子和trpa终止子。
[0104]
可以在各种不同微生物中使用的载体、启动子和终止子被详细描述在例如“微生物学、基因工程基础讲义8”(basic lecture 8on microbiology,gene engineering)，kyoritsu shuppan,1987中，并且可以使用它们。
[0105]
此外，在引入两个或更多个基因的情况下，各个基因以可表达方式保留在本发明的细菌中就已足够。例如，各个基因可以都保留在单一表达载体上，或者可以全都保留在染色体上。此外，各个基因可以分开地保留在多个表达载体上，或者可以分开地保留在单一或多个表达载体上以及染色体上。此外，两个或更多个基因可以形成操纵子并被引入。“其中引入两个或更多个基因的情况”的实例包括引入分别编码两种或更多种酶的基因的情况、引入分别编码形成单个酶的两个或更多个亚基的基因的情况及其组合。
[0106]
对待引入的基因没有特别限制，只要它编码在宿主中起作用的蛋白质即可。所述待引入的基因可以是源自于宿主的基因或异源基因。所述待引入的基因可以例如使用在所述基因的核苷酸序列的基础上设计的引物并使用具有所述基因的生物体的基因组dna或带有所述基因的质粒等作为模板，通过pcr来获得。此外，所述待引入的基因可以例如在所述基因的核苷酸序列的基础上全合成[gene,60(1),115-127(1987)]。
[0107]
此外，基因表达的提高可以通过提高基因的转录效率来实现。提高基因的转录效率可以通过例如将染色体上的基因启动子用较强启动子代替来实现。所述“较强启动子”是指与天然存在的野生型启动子相比增强基因转录的启动子。
[0108]
所述“较强启动子”的实例包括已知的高表达启动子，例如uspa启动子、t7启动子、trp启动子、lac启动子、thr启动子、tac启动子、trc启动子、tet启动子、arabad启动子、rpoh启动子、pr启动子和pl启动子。
[0109]
此外，作为较强启动子，可以使用各种不同的报告基因获得高活性类型的常规启动子。例如，通过使启动子区中的-35和-10区更接近于共有序列，可以提高启动子的活性(wo2000/18935)。
[0110]
高活性类型启动子的实例包括各种不同的tac样启动子(katashkina ji等，俄罗斯联邦专利申请2006134574)和pnlp8启动子(wo2010/027045)。用于评估启动子强度的方法和强启动子的实例被描述在已知文献中[“生物技术中的原核启动子”(prokaryotic promoters in biotechnology)，biotechnol.annu.rev.,1,105-128(1995)等]。
[0111]
此外，基因表达水平的提高可以通过提高基因的翻译效率来实现。基因翻译效率的提高可以通过例如将染色体上所述基因的shine-dalgarno(sd)序列(也被称为核糖体结合位点(rbs))用较强sd序列代替来实现。
[0112]
所述“较强sd序列”是指与天然存在的野生型sd序列相比提高mrna翻译的sd序列。较强sd序列的实例包括来自于噬菌体t7的基因10的rbs(olins p.o.等，gene,1988,73,227-235)。此外，已知在rbs与起始密码子之间的间隔区中、特别是紧靠起始密码子上游的序列(5
’‑
utr)中几个核苷酸的替换、插入或缺失显著影响mrna的稳定性和翻译效率，因此可以通过修饰它们来提高基因的翻译效率。
[0113]
在本发明中，影响基因表达的位点例如启动子、sd序列和rbs与起始密码子之间的间隔区，也被合称为“表达控制区”。表达控制区可以使用基因搜索软件例如启动子搜索载体或genetyx来确定。这些表达控制区的修饰可以通过例如使用温度敏感性载体的方法或red驱动的整合方法(wo2005/010175)来进行。
[0114]
基因翻译效率的提高也可以通过例如密码子修饰来实现。具体来说，例如在进行基因的异源表达等的情况下，可以通过将所述基因中存在的稀有密码子用更频繁使用的同义密码子代替，来提高所述基因的翻译效率。
[0115]
密码子替换可以通过例如定点突变方法来进行，其中将靶突变引入到dna中的靶位点中。定点突变方法的实例包括使用pcr的方法[higuchi,r.,61，《pcr技术》(pcr technology)，erlich,h.a.主编，stockton press(1989)；carter,p.,meth.in enzymol.,154,382(1987)]和使用噬菌体的方法[kramer,w.和frits,h.j.，meth.in enzymol.,154,350(1987)；kunkel,t.a.等，meth.in enzymol.,154,367(1987)]。或者，可以全合成其中密码子已被替换的基因片段。各种不同生物体中的密码子使用频率被描述在“密码子使用数据库”(codon usage database)[http://www.kazusa.or.jp/codon；nakamura,y.等，nucl.acids res.,28,292(2000)]中。
[0116]
此外，基因的表达也可以通过扩增提高基因表达的调控物或通过缺失或弱化降低基因表达的调控物来提高。如上所述的此类用于提高基因表达的技术可以单独使用，或者可以以任何组合使用。
[0117]
可以例如通过检查基因转录量的提高或通过检查从所述基因表达的蛋白质的量的提高，来检查基因表达的提高。此外，可以例如通过检测从基因表达的蛋白质的活性的提高，来检查基因表达的提高。
[0118]
检查基因转录量的提高可以通过将从所述基因转录的mrna的量与未修饰的菌株例如野生菌株或亲本菌株进行比较来进行。用于评估mrna的量的方法的实例包括northern杂交、rt-pcr等，[sambrook,j.等，《分子克隆实验指南》(molecular cloning a laboratory manual)第三版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor(usa),2001]。mrna量的提高是指例如与未修饰的菌株相比，mrna的量优选地提高1.5倍或更多，更优选地提高2倍或更多，甚至更优选地提高3倍或更多的情况。
[0119]
蛋白质的量的提高可以通过例如使用抗体的western印迹来检查。蛋白质的量的提高是指例如与未修饰的菌株相比，蛋白质的量优选地提高1.5倍或更多，更优选地提高2倍或更多，甚至更优选地提高3倍或更多的情况。
[0120]
蛋白质活性的提高可以通过例如测量所述蛋白质的活性来检查。蛋白质活性的提高是指例如与未修饰的菌株相比，蛋白质的活性优选地提高1.5倍或更多，更优选地提高2倍或更多，甚至更优选地提高3倍或更多的情况。
[0121]
上述用于提高基因表达的技术可用于增强上述基因(1)和(2)中的每一者的表达。
[0122]
提高kpss基因表达的遗传修饰优选是kpss基因的表达控制区的修饰和增加拷贝数的遗传修饰中的至少一者。kpsfeducs基因作为生产肝素原的基因群存在，但正如后面将在实施例中描述的，本发明的发明人发现，通过提高它们之中仅仅kpss基因的表达，获得了特别提高肝素原生产的效果。因此，作为提高kpss基因表达的遗传修饰，用于提高kpss基因的拷贝数的遗传修饰是特别优选的。
[0123]
尽管本发明的细菌具有提高kpss基因表达的遗传修饰，但本发明的细菌优选地不具有提高kpsc基因表达的遗传修饰，更优选地不具有提高kpsc基因和选自kpsf、kpse、kpsd和kpsu基因的至少一个基因的表达的遗传修饰，并且最优选地不具有提高所有kpsc、kpsf、kpse、kpsd和kpsu基因的表达的遗传修饰。
[0124]
提高选自kfia、kfib、kfic和kfid基因的至少一个基因的表达的遗传修饰，优选是选自kfia、kfib、kfic和kfid基因的至少一个基因的表达控制区的修饰和增加所述基因的拷贝数中的至少一者。如图1中所示，kfia、kfib、kfic和kfid基因构成操纵子。增强由kfia、kfib、kfic和kfid基因构成的整个操纵子的遗传修饰是优选的，并且kfia、kfib、kfic和kfid基因的表达控制区的修饰是更加优选的。
[0125]
《《引起基因功能丧失的遗传修饰》》
[0126]
上述(3)的引起yhbj基因的功能丧失的遗传修饰，包括其中通过修饰编码作为宿主的埃希氏杆菌属细菌的基因组dna中对应于yhbj的部分的dna(引起yhbj基因功能丧失)，使由所述对应于yhbj的部分编码的蛋白质的功能降低或完全停止的遗传修饰。
[0127]
在本发明的方法中，对添加到编码所述对应于yhbj的部分的dna的修饰的形式没有特别限制，只要由所述对应于yhbj的部分编码的蛋白质的功能被降低或完全停止即可，并且可以适合地使用已知的方法。
[0128]
降低或完全停止由所述对应于yhbj的部分编码的蛋白质的功能的形式的实例包括下述修饰(a)至(c)中的任一者：
[0129]
(a)除去编码所述对应于yhbj的部分的dna的全部或一部分，
[0130]
(b)对编码所述对应于yhbj的部分的dna做出一个或几个替换、缺失或添加，和
[0131]
(c)将编码所述对应于yhbj的部分的dna用与修饰前的dna序列具有低于80％同一性的dna序列代替。
[0132]
yhbj基因的功能丧失的实例包括其中与未修饰的菌株相比，yhbj基因的活性优选为20％或更低，更优选地10％或更低，甚至更优选地5％或更低的情况。yhbj的活性可以通过用northern印迹法、western印迹法等检查glms的表达水平来检查[kalamorz f.等，(2007)，“大肠埃希氏杆菌中葡萄糖胺-6-磷酸合酶glms表达的反馈控制依赖于小rna glmz并涉及新蛋白yhbj”(feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase glms expression depends on the small rna glmz and involves the novel protein yhbj in escherichia coli)，mol microbiol.65(6):1518-33]。
[0133]
《《埃希氏杆菌属细菌》》
[0134]
对所述属于埃希氏杆菌属的细菌没有特别限制，其实例包括通过微生物学专家已知的分类法分类到埃希氏杆菌属中的细菌。属于埃希氏杆菌属的细菌的实例包括文献中描述的细菌[backmann,b.j.1996.大肠埃希氏杆菌k-12的衍生菌株和某些突变衍生菌株的基因型(derivations and genotypes of some mutant derivatives of escherichia coli k-12)，p.2460-2488，表1，f.d.neidhardt主编的《大肠埃希氏杆菌和沙门氏菌细胞和分子生物学》(escherichia coli and salmonella cellular and molecular biology)第二版，american society for microbiology press,washington,dc]。
[0135]
属于埃希氏杆菌属的细菌的实例包括大肠埃希氏杆菌。大肠埃希氏杆菌的实例包括大肠埃希氏杆菌k-12菌株例如w3110菌株(atcc 27325)和mg1655菌株(atcc 47076)，大肠埃希氏杆菌k5菌株(atcc 23506)，大肠埃希氏杆菌b菌株例如bl21(de3)菌株，大肠埃希氏杆菌nissle 1917菌株(dsm 6601)，及其衍生菌株。
[0136]
这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)(地址：12301parklawn drive,rockville,maryland 20852,p.o.box 1549,manassas,va 20108,united states of america)订购。也就是说，每个菌株被提供有登记号，并且可以使用该登记号订购所述菌株(参见https://www.atcc.org/)。对应于每个菌株的登记号描述在美国典型培养物保藏中心的目录中。此外，bl21(de3)菌株可以从例如life technologies(产品号c6000-03)获得。
[0137]
本发明的细菌可能原本具有肝素原生产能力，或者可能已被修饰成具有肝素原生产能力。具有肝素原生产能力的细菌可以通过例如向上述细菌提供肝素原生产能力来获得。
[0138]
肝素原生产能力可以通过引入编码参与肝素原生产的蛋白质的基因来提供，参考metabolic engineering 14(2012)521-527；carbohydrate research 360(2012)19-24；美国专利号9,975,928等。参与肝素原生产的蛋白质的实例包括糖基转移酶和肝素原外排载体蛋白。在本发明中，可以引入一种基因，或者可以引入两种或更多种基因。基因的引入可以以与上述用于增加基因拷贝数的方法中相同的方式来进行。
[0139]
《用于生产肝素原的方法》
[0140]
本发明的用于生产肝素原的方法包括将本发明的细菌在培养基中培养，以在所述
培养基中产生并积累肝素原。如果需要，本发明的用于生产肝素原的方法还可以包括从所述培养基收集肝素原。
[0141]
对使用的培养基没有特别限制，只要本发明的细菌可以生长并且可以产生并积累肝素原即可。作为培养基，可以使用例如用于培养细菌的普通培养基。培养基的实例包括lb培养基(luria-bertani培养基)，但实例不限于此。作为培养基，可以使用例如含有选自碳源、氮源、磷源、硫源的组分以及如果需要的话其他各种不同有机组分和无机组分的培养基。本领域技术人员可以适合地设定培养基组分的类型和浓度。
[0142]
对碳源没有特别限制，只要它可以被本发明的细菌利用以便可以产生肝素原即可。碳源的实例包括糖类例如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、糖蜜、淀粉水解物和生物质水解物，有机酸例如乙酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸和苹果酸，醇类例如甘油、粗甘油和乙醇，以及脂肪酸。作为碳源，可以使用一种碳源，也可以组合两种或更多种碳源。
[0143]
氮源的实例包括铵盐例如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮源例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物和大豆蛋白分解产物，氨和尿素。作为氮源，可以使用一种氮源，也可以组合两种或更多种氮源。
[0144]
磷源的实例包括磷酸盐例如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，以及磷酸聚合物例如焦磷酸。作为磷源，可以使用一种磷源，也可以组合两种或更多种磷源。
[0145]
硫源的实例包括无机硫化合物例如硫酸盐、硫代硫酸盐和亚硫酸盐，以及含硫氨基酸例如半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽。作为硫源，可以使用一种硫源，或者可以组合两种或更多种硫源。
[0146]
其他各种不同有机组分和无机组分的具体实例包括无机盐例如氯化钠和氯化钾，微量金属例如铁、锰、镁和钙，维生素例如维生素b1、维生素b2、维生素b6、烟酸、烟酰胺和维生素b12，氨基酸，核酸，含有它们的有机组分例如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白分解产物。作为其他各种不同有机组分和无机组分，可以使用一种组分，也可以组合使用两种或更多种组分。
[0147]
此外，在使用需要氨基酸等来生长的营养缺陷型突变体的情况下，优选地向培养基补充所需的营养物。此外，在使用带有抗生素抗性基因的载体来引入基因时，优选地向培养基添加相应的抗生素。
[0148]
对培养条件没有特别限制，只要本发明的细菌可以生长并产生和积累肝素原即可。培养可以例如在用于培养细菌的正常条件下进行。培养条件可以由本领域技术人员适合地设置。
[0149]
培养可以好氧进行，例如通过通气培养或使用液体培养基的振摇培养。培养温度可以是例如30℃至37℃。培养时间可以是例如16至72小时。培养可以通过分批培养、补料分批培养、连续培养或其组合来进行。此外，培养可以分为预培养和主培养。所述预培养可以使用例如平板培养基或液体培养基来进行。
[0150]
通过培养如上所述本发明的细菌，肝素原积累在培养基中。
[0151]
对用于从培养液收集肝素原的方法没有特别限制，只要可以收集肝素原即可。用于从培养液收集肝素原的方法的实例包括在实施例中描述的方法。具体来说，例如，可以从培养液分离培养上清液，接下来可以通过乙醇沉淀来沉淀上清液中的肝素原。添加的乙醇
的量可以是例如上清液的量的2.5至3.5倍。为了沉淀肝素原，不仅可以使用乙醇，而且可以使用任选地与水混溶的有机溶剂。
[0152]
有机溶剂的实例包括乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、仲丁醇、丙二醇、乙腈、丙酮、dmf、dmso、n-甲基吡咯烷酮、吡啶、1,2-二甲氧基乙烷、1,4-二烷和thf。
[0153]
用于从培养液收集肝素原的方法的其他实例包括通过靶向存在于肝素原末端处的kdo来纯化肝素原的方法。
[0154]
可以将沉淀的肝素原溶解在例如两倍于原始上清液的量的水中。除了肝素原之外，收集的肝素原可能还含有诸如细菌细胞、培养基组分、水和细菌的代谢副产物等的组分。肝素原可以被纯化到所需程度。肝素原的纯度可以是例如30％(w/w)或更高、50％(w/w)或更高、70％(w/w)或更高、80％(w/w)或更高、90％(w/w)或更高或95％(w/w)或更高。
[0155]
肝素原的检测和定量可以通过已知方法来进行。具体来说，例如，肝素原可以通过咔唑法来检测和定量，正如将在后文实施例中描述的。咔唑法是一种广泛用作糖醛酸定量方法的方法，并且可以通过在硫酸存在下将肝素原与咔唑热反应，并测量产生的着色物质在530nm处的吸收来检测和定量肝素原[bitter t.和muir h.m.，(1962)，“改良的糖醛酸咔唑反应”(a modified uronic acid carbazole reaction)，analytical biochemistry,4(4):330-334]。此外，例如，可以通过将肝素原与作为肝素原降解酶的肝素酶iii反应并进行二糖组成分析，来检测和定量肝素原。
[0156]
实施例
[0157]
下面示出了实施例，但本发明不限于下述实施例。
[0158]
[实施例1]
[0159]
基因缺失菌株的构建
[0160]
(a)用于基因缺失的标志物基因片段的构建
[0161]
如下所述制备含有用作标志物基因的氯霉素抗性基因(cat)和果聚糖蔗糖酶基因(sacb)的dna片段，其被用于使用同源重组来缺失大肠埃希氏杆菌的基因。
[0162]
使用由seq id no：1和2中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集，并使用质粒phsg396(takara bio inc.)作为模板进行pcr，从而获得包含cat基因的dna片段。所述pcr使用primestar max dna聚合酶(takara bio inc.)，按照说明手册中的描述来进行。此外，使用由seq id no：3和4中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集，并使用pmob3(源自于atcc 77282)作为模板进行pcr，从而获得包含sacb基因的dna片段。
[0163]
在纯化所述包含cat基因的dna片段和包含sacb基因的dna片段后，将所述dna片段用sali切割。进行苯酚/氯仿处理和乙醇沉淀，将所述两个片段以等摩尔比例混合，并使用dna连接试剂盒ver.2(takara bio inc.)连接。对连接反应溶液进行苯酚/氯仿处理并通过乙醇沉淀进行纯化，并使用由此获得的产物作为模板，使用由seq id no：5和6中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集进行pcr。使用qiaquick pcr纯化试剂盒(qiagen)纯化得到的扩增dna，从而获得包含cat基因和sacb基因的dna片段(cat-sacb片段)。
[0164]
(b)yhbj缺陷菌株的构建
[0165]
使用由seq id no：7和8中示出的核苷酸序列组成的合成dna和由seq id no：9和10中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集，并使用通过常规方法制备的大肠埃希氏杆菌nissle 1917菌株[dsm 6601，mutaflor(pharma-zentrale gmbh)，在后文中简称为
nissle菌株]的基因组dna作为模板，进行第一次pcr。结果，获得了分别包含yhbj基因的起始密码子附近上游1000bp和yhbj基因的终止密码子附近下游约1000bp的dna片段。所述pcr使用primestar max dna聚合酶(takara bio inc.)，按照说明手册中的描述来进行。
[0166]
将使用qiaquick pcr纯化试剂盒(由qiagen制造)纯化的扩增产物与cat-sacb片段以等摩尔比例混合获得混合物，使用所述混合物作为模板进行第二次pcr。所述pcr使用primestar gxl dna聚合酶(takara bio inc.)，按照说明手册中的描述来进行。对于引物集来说，使用由seq id no：7和10中示出的核苷酸序列组成的合成dna。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以分离约4.6kbp的dna片段，从而获得包含其中插入有cat-sacb片段的yhbj外周区的dna片段。
[0167]
此外，使用由seq id no：7和11中示出的核苷酸序列组成的合成dna和由seq id no：12和10中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集，并使用大肠埃希氏杆菌nissle菌株的基因组dna作为模板，进行第一次pcr。结果，获得了分别包含yhbj基因的起始密码子附近上游1000bp和yhbj基因的终止密码子附近下游约1000bp的dna片段。
[0168]
将所述纯化的扩增产物以等摩尔比例混合获得混合物，使用所述混合物作为模板进行第二次pcr。对于引物集来说，使用由seq id no：7和10中示出的核苷酸序列组成的合成dna。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以分离约2.0kbp的dna片段，从而获得包含缺少yhbj基因的yhbj外周区的dna片段。
[0169]
接下来，将保留了pkd46的大肠埃希氏杆菌nissle菌株(nissle/pkd46菌株)在lb培养基[10g/l细菌蛋白胨(由difco制造)，5g/l酵母提取物(由difco制造)和5g/l氯化钠]中，在15g/l l-阿拉伯糖和100mg/l氨苄青霉素存在下培养。质粒pkd46具有λred重组酶基因，因此可以通过l-阿拉伯糖来诱导基因的表达。因此，当使用线性dna转化在l-阿拉伯糖存在下生长的保留pkd46的大肠埃希氏杆菌时，同源重组以高频率发生。此外，由于pkd46具有温度敏感性复制原点，因此可以通过在42℃生长pkd46容易地除掉所述质粒。制备nissle/pkd46菌株的感受态细胞，并通过电穿孔向其引入包含其中插入有上文得到的cat-sacb片段的yhbj外周区的dna片段。
[0170]
将得到的转化体施加到含有15mg/l氯霉素和100mg/l氨苄青霉素的lb琼脂培养基(lb 氯霉素 氨苄青霉素)并培养，选择氯霉素抗性菌落。由于其中发生同源重组的菌株对氯霉素有抗性并对蔗糖敏感，因此将选出的菌落复制在含有10％蔗糖和100mg/l氨苄青霉素的lb琼脂培养基(lb 蔗糖 氨苄青霉素)和lb 氯霉素 氨苄青霉素中，从而选择显示出氯霉素抗性和蔗糖敏感性的菌株。
[0171]
使用由seq id no：13和10中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集对选择的菌株进行菌落pcr，并检查cat-sacb片段被插入在yhbj基因的位置处。将其中cat-sacb片段被插入在yhbj基因的位置处的菌株以与上述相同的方式培养来制备感受态细胞，并通过电穿孔向其引入上文得到的含有缺少yhbj基因的yhbj外周区的dna片段。
[0172]
将得到的转化体在lb 蔗糖琼脂培养基上培养，并选择蔗糖抗性菌落。由于经历同源重组的菌株不含cat-sacb片段并因此对氯霉素敏感并对蔗糖有抗性，因此将选出的菌落复制在lb 氯霉素琼脂培养基和lb 蔗糖琼脂培养基中，从而选择显示出氯霉素敏感性和蔗糖抗性的菌株。
[0173]
使用由seq id no：13和10中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集对选出
的菌株进行菌落pcr，并检查yhbj基因被缺失。将其中检查到yhbj基因被缺失的菌株施加到lb琼脂培养基并在42℃下培养，然后选择显示出氨苄青霉素敏感性的菌株，即pkd46已被除去的菌株。
[0174]
如上所述得到其中yhbj基因缺陷的菌株，并将其命名为大肠埃希氏杆菌ny菌株。
[0175]
[实施例2]
[0176]
基因增强菌株的构建
[0177]
通过下述方法构建了kfia基因的启动子区替换菌株。使用由seq id no：14和15中示出的核苷酸序列组成的合成dna和由seq id no：16和17中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集，并使用通过通用方法制备的大肠埃希氏杆菌nissle菌株的基因组dna作为模板，进行第一次pcr。结果，得到分别包含kfia基因的起始密码子上游100bp左右上游的1000bp和kfia基因的起始密码子附近下游约1000bp的dna片段。
[0178]
将使用qiaquick pcr纯化试剂盒(由qiagen制造)纯化的扩增产物与cat-sacb片段以等摩尔比例混合以得到混合物，使用所述混合物作为模板进行第二次pcr。对于引物集来说，使用由seq id no：14和17中示出的核苷酸序列组成的合成dna。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以分离约4.6kbp的dna片段，从而获得包含其中插入有cat-sacb片段的kfia基因的启动子外周区的dna片段。
[0179]
使用由seq id no：14和18中示出的核苷酸序列组成的合成dna和由seq id no：19和17中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集，并使用通过通用方法制备的大肠埃希氏杆菌nissle菌株的基因组dna作为模板，进行第一次pcr。结果，得到分别包含kfia基因的起始密码子上游100bp左右上游的1000bp和kfia基因的起始密码子附近下游约1000bp的dna片段。
[0180]
此外，使用由seq id no：20和21中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集并使用通过通用方法制备的大肠埃希氏杆菌w菌株(atcc 9637)的基因组dna作为模板进行pcr，从而得到包含uspa启动子的约300bp的dna片段。
[0181]
将所述纯化的扩增产物以等摩尔比例混合得到混合物，使用所述混合物作为模板进行第二次pcr。对于引物集来说，使用由seq id no：14和17中示出的核苷酸序列组成的合成dna。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以分离约2.3kbp的dna片段，从而得到来自于kfia启动子外周区的缺少kfia启动子区但代之以包含uspa启动子的dna片段。
[0182]
接下来，将保留了含有编码γred重组酶的基因的质粒pkd46的大肠埃希氏杆菌nissle菌株(nissle/pkd46菌株)和在实施例1中构建的大肠埃希氏杆菌ny菌株(ny/pkd46菌株)在15g/l l-阿拉伯糖和100mg/l氨苄青霉素存在下进行培养。制备两种菌株的感受态细胞，并通过电穿孔向其引入包含其中插入有如上获得的cat-sacb片段的kfia启动子外周区的dna片段。
[0183]
将得到的转化体在lb 氯霉素 氨苄青霉素琼脂培养基上培养并选择氯霉素抗性菌落。从所述选出的菌落进一步选择表现出氯霉素抗性和蔗糖敏感性的菌株。
[0184]
使用由seq id no：22和17中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集对选出的菌株进行菌落pcr，并检查cat-sacb片段被插入到kfia启动子区中。
[0185]
将其中cat-sacb片段被插入到kfia启动子区中的菌株以与上述相同的方式培养以制备感受态细胞，并通过电穿孔向其引入上文得到的从kfia启动子外周区中缺少kfia启
动子区但代之以包含uspa启动子的dna片段。
[0186]
将得到的转化体在lb 蔗糖琼脂培养基上培养，并选择蔗糖抗性菌落。从选出的菌落进一步选择显示出氯霉素敏感性和蔗糖抗性的菌株。
[0187]
使用由seq id no：22和17中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集对选出的菌株进行菌落pcr，并检查uspa启动子被插入到kfia启动子区中。将其中检查到uspa启动子被插入到kfia启动子区中的菌株施加到lb琼脂培养基并在42℃下培养，然后选择显示出氨苄青霉素敏感性的菌株，即pkd46已被除去的菌株。
[0188]
得到如上所述其中uspa启动子被插入到kfia启动子区中的菌株，并将它们分别命名为大肠埃希氏杆菌na菌株和nya菌株。
[0189]
[实施例3]
[0190]
使用ny菌株、na菌株和nya菌株的肝素原生产试验
[0191]
(a)产肝素原菌株的培养
[0192]
将实施例1中得到的yhbj缺陷型突变体ny菌株、实施例2中得到的kfia启动子替换菌株na菌株和kfia启动子替换yhbj缺陷型菌株nya菌株以及作为亲本菌株的nissle菌株在lb琼脂培养基上，在30℃培养24小时，并分别接种到2l挡板摇瓶中，所述摇瓶含有330ml预培养培养基[10g/l大豆肽(hinute am；由fuji oil co.,ltd.制造)，5g/l氯化钠，5g/l酵母提取物粉(ay-80；由asahi food and healthcare co.,ltd.制造)，用氢氧化钠调节以使ph变成ph 7.2]，并在30℃培养18小时。
[0193]
在含有760ml主培养培养基[20g/l葡萄糖，13.5g/l磷酸二氢钾，4g/l磷酸氢二铵，1.7g/l柠檬酸，1.7g/l七水硫酸镁，10mg/l盐酸硫胺素和10ml/l微量矿物质溶液，用5mol/l氢氧化钠调节以使ph变成ph 6.7，并且葡萄糖和七水硫酸镁在压热灭菌(120℃下20分钟)后单独添加]的发酵罐中接种40ml得到的预培养物，并在800rpm的搅拌速度和1.5l/min的通气速率下，在37℃培养72小时。
[0194]
所述微量矿物质溶液是指将10g/l七水硫酸铁、2g/l氯化钙、2.2g/l七水硫酸锌、0.5g/l四水硫酸锰、1g/l五水硫酸铜、0.1g/l四水七钼酸六铵和0.02g/l十水四硼酸钠溶解在5mol/l盐酸中的溶液。
[0195]
从培养液中的葡萄糖浓度变为0g/l的时间(0小时)至72小时，以7.0ml/小时的速率添加补料溶液[500g/l葡萄糖，33.6g/l磷酸二氢钾，14.3g/l硫酸镁，0.4g/l盐酸硫胺素和14.3ml/l微量矿物质溶液]。到培养结束时添加的补料溶液的量为约450ml。
[0196]
(b)从产肝素原菌株的培养液部分纯化肝素原
[0197]
在将用蒸馏水稀释10倍的培养液在100℃下温育30分钟后，通过离心从培养液除去细菌细胞，将200微升得到的上清液转移到1.5ml eppendorf管。在添加40微升0.5mol/l硫酸钠水溶液并混合后，添加400微升10g/l十六烷基氯化吡啶水溶液并颠倒混合，允许混合物在37℃下静置1小时。
[0198]
将所述溶液离心以形成沉淀物并除去上清液。在用蒸馏水清洗沉淀物后，添加100微升溶液[含有0.5mol/l氯化钠和4％(v/v)乙醇的水性溶液]以溶解所述沉淀物。在进一步允许在4℃静置过夜后，添加900微升0.25mol/l氯化钠水溶液并混合，由此获得粗品肝素原溶液。通过以相同方式处理200微升主培养培养基，也制备了空白。
[0199]
(c)通过咔唑-硫酸法测量积累的肝素原的量
[0200]
在将20微升粗品肝素原溶液冰冷却的同时，添加100微升硫酸溶液[将9.5g/l十水四硼酸钠溶解在浓硫酸中的溶液]并混合，然后在100℃温育10分钟。在将所述溶液再次冰冷却的同时，向其添加4微升咔唑溶液[将1.25g/l咔唑溶解在100％乙醇中的溶液]并混合，并在100℃温育15分钟。
[0201]
在将所述溶液再次冰冷却后，将温度返回到室温，并使用微孔板读板器测量530nm处的吸光度。将0、0.1和0.2g/l单水葡萄糖醛酸钠用于校准曲线，校准曲线使用葡萄糖醛酸浓度(g/l)作为水平轴并使用530nm处的吸光度作为竖直轴来产生。
[0202]
根据下述计算表达式来计算肝素原浓度。其中所需肝素原浓度代表h(g/l)，得到的校准曲线代表y＝ax b，粗品肝素原样品的a530测量值代表h，空白a530测量值代表k，并且最终稀释比率代表n。0.5387指示肝素原中的葡萄糖醛酸含量，216/234指示单水葡萄糖醛酸钠中葡萄糖醛酸钠的含量。
[0203]
[数学表达式1]
[0204][0205]
(d)测量积累的肝素原的量的结果
[0206]
表1示出了当通过上述方法测量时积累的肝素原的量。
[0207]
[表1]
[0208]
菌株积累的肝素原的量(g/l)nissle3.9ny9.9na5.5nya12.5
[0209]
如表1中所示，在yhbj缺陷的ny菌株中积累的肝素原的量为亲本菌株nissle中的超过两倍高。此外，即使在kfia启动子被uspa启动子代替的na菌株中，与亲本菌株nissle中相比积累的肝素原的量也提高。其中组合了这两种突变的nya菌株显示出甚至更高的肝素原生产率。
[0210]
[实施例4]
[0211]
表达参与肝素原生产的基因的质粒的构建
[0212]
使用大肠埃希氏杆菌nissle菌株的染色体dna作为模板，并使用由seq id no：23和24中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集进行pcr反应，从而获得约3.3kbp的含有kpsc和kpss基因区的dna片段(在后文中被称为kpscs基因扩增片段)。
[0213]
使用pmw118载体作为模板并使用由seq id no：25和26中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集进行pcr反应，从而获得约4kbp的pmw118线性dna片段。此外，使用大肠埃希氏杆菌w菌株(atcc 9637)的染色体dna作为模板，并使用由seq id no：20和21中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集进行pcr反应，从而获得约300bp的包含uspa启动子区的dna片段。
[0214]
将如上所述获得的pmw118线性dna片段、含有uspa启动子区的dna片段和kpscs基因扩增片段混合，并使用in-fusion hd克隆试剂盒(takara bio inc.)连接。
[0215]
使用得到的连接的dna转化大肠埃希氏杆菌dh5α菌株，并使用氨苄青霉素抗性作为指标选择转化体。按照已知方法从所述转化体提取质粒，并使用由seq id no：27和24中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集进行pcr反应，从而检查出得到了基因表达质粒，将其命名为pmw118-kpscs。
[0216]
此外，使用大肠埃希氏杆菌nissle菌株的染色体dna作为模板，并使用由seq id no：28和24中示出的核苷酸序列组成的合成dna和由seq id no：29和24中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集进行pcr反应，从而分别获得约1.2kbp的含有kpss基因区的dna片段(在后文中被称为kpss基因扩增片段)和约7.9kbp的含有kpsf、kpse、kpsd、kpsu、kpsc和kpss基因区的dna片段(在后文中被称为kpsfeducs基因扩增片段)。
[0217]
此外，使用如上所述获得的质粒pmw118-kpscs作为模板，并使用由seq id no：25和21中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为引物集进行pcr反应，从而获得约4.3kbp的含有uspa启动子序列的pmw118线性dna片段。
[0218]
将上文得到的含有uspa启动子序列的pmw118线性dna片段和kpss基因扩增片段混合，并使用in-fusion hd克隆试剂盒(takara bio inc.)连接。以同样的方式将包含uspa启动子序列的pmw118线性dna片段和kpsfeducs基因扩增片段混合并连接。
[0219]
用得到的每种连接的dna转化大肠埃希氏杆菌dh5α菌株，并使用氨苄青霉素抗性作为指标选择转化体。按照已知方法从所述转化体提取质粒，并使用由seq id no：20和24中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为用于连接有kpss基因扩增片段的质粒的引物集，使用由seq id no：27和30中示出的核苷酸序列组成的合成dna和由seq id no：31和32中示出的核苷酸序列组成的合成dna作为用于连接有kpsfeducs基因扩增片段的质粒的引物集进行pcr反应。因此，检查到已分别获得表达所述基因的质粒，并将其分别命名为pmw118-kpss和pmw118-kpsfeducs。
[0220]
[实施例5]
[0221]
使用保留基因表达质粒的菌株的肝素原生产试验-1
[0222]
将pmw118质粒和在实施例4中得到的pmw118-puspa-kpss、pmw118-puspa-kpscs和pmw118-puspa-kpsfeducs分别转化到在实施例1中得到的ny菌株。得到的转化体被分别命名为ny/pmw118菌株、ny/pmw118-puspa-kpss菌株、ny/pmw118-puspa-kpscs菌株和ny/pmw118-puspa-kpsfeducs菌株。
[0223]
将上述得到的转化体接种到含有5ml lb培养基并含有100mg/l氨苄青霉素的大试管中，在37℃培养15小时。将1％的培养液接种到含有5ml含有100mg/l氨苄青霉素的r培养基[含有20g/l葡萄糖，13.5g/l磷酸二氢钾，4g/l磷酸氢二铵，1.7g/l柠檬酸，1g/l七水硫酸镁，10mg/l盐酸硫胺素和10ml/l微量矿物质溶液，用5mol/l氢氧化钠调节以使ph变为ph 6.8，并且葡萄糖和七水硫酸镁在压热灭菌(120℃下20分钟)后单独添加]的大试管中，并在37℃培养24小时。此外，在不含氨苄青霉素的条件下对ny菌株进行相同的操作。
[0224]
通过实施例3中描述的方法处理得到的培养液，并测量培养液中积累的肝素原的量。结果示出在表2中。
[0225]
[表2]
[0226]
菌株积累的肝素原的量(mg/l)ny192
ny/pmw118220ny/pmw118-puspa-kpss349ny/pmw118-puspa-kpscs328ny/pmw118-puspa-kpsfeducs348
[0227]
如表2中所示，与亲本菌株ny和仅保留pmw118载体的ny/pmw118菌株相比，在表达kpss的ny/pmw118-puspa-kpss菌株中积累的肝素原的量明显增加。
[0228]
同时，基于表达kpsc和kpss的ny/pmw118-puspa-kpscs菌株和表达kpsf、kpse、kpsd、kpsu、kpsc和kpss的ny/pmw118-puspa-kpsfeducs菌株显示出与ny/pmw118-puspa-kpss菌株几乎相同的肝素原生产率的结果，发现通过增强作为肝素原生产基因群的kpsfeducs中的仅仅kpss的表达就充分获得了提高肝素原生产能力的效果。
[0229]
[实施例6]
[0230]
使用保留基因表达质粒的菌株的肝素原生产试验-2
[0231]
将pmw118质粒和在实施例4中得到的pmw118-puspa-kpss、pmw118-puspa-kpscs和pmw118-puspa-kpsfeducs分别转化到大肠埃希氏杆菌nissle的野生型菌株。得到的转化体被分别命名为n/pmw118菌株、n/pmw118-puspa-kpss菌株、n/pmw118-puspa-kpscs菌株和n/pmw118-puspa-kpsfeducs菌株。
[0232]
将上述得到的转化体接种到含有5ml lb培养基并含有100mg/l氨苄青霉素的大试管中，在37℃培养15小时。将1％的培养液接种到含有5ml含有100mg/l氨苄青霉素的r培养基[含有20g/l葡萄糖，13.5g/l磷酸二氢钾，4g/l磷酸氢二铵，1.7g/l柠檬酸，1g/l七水硫酸镁，10mg/l盐酸硫胺素和10ml/l微量矿物质溶液，用5mol/l氢氧化钠调节以使ph变为ph 6.8，并且葡萄糖和七水硫酸镁在压热灭菌(120℃下20分钟)后单独添加]的大试管中，并在37℃培养24小时。此外，在不含氨苄青霉素的条件下对野生型nissle菌株进行相同的操作。
[0233]
通过实施例3中描述的方法处理得到的培养液，并测量培养液中积累的肝素原的量。结果示出在表3中。
[0234]
[表3]
[0235][0236]
如表3中所示，与亲本野生型nissle菌株和仅保留pmw118载体的n/pmw118菌株相比，在表达kpss的n/pmw118-puspa-kpss菌株中积累的肝素原的量提高三倍以上。
[0237]
同时，在表达kpsc和kpss的n/pmw118-puspa-kpscs菌株和表达kpsf、kpse、kpsd、kpsu、kpsc和kpss的n/pmw118-puspa-kpsfeducs菌株中，滴度被提高到亲本菌株的至多1.8倍。就此而言，发现通过增强肝素原生产基因群kpsfeducs中的仅仅kpss的表达就充分获得
了提高肝素原生产能力的效果，并且当kpsc和kpsfedu的表达不被增强而不是被增强时，肝素原生产能力变得更高。
[0238]
尽管本发明已参考其具体实施方式进行了详细描述，但对于本领域技术人员来说，显然可以在其中做出各种不同的改变和修改而不背离其精神和范围。本文中引用的所有参考文献整体并入本文。本技术是基于2020年4月3日提交的国际申请号pct/jp2020/015384，其全部内容通过参考并入本文。