一种银杏DPP-Ⅳ抑制肽的制备方法

一种银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽的制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽的制备方法，属于食品与生物技术领域。


背景技术：

2.我国银杏资源丰富，产量较大，银杏干制品中蛋白含量丰富，银杏蛋白氨基酸组成合理，为优质植物蛋白，球蛋白和清蛋白为银杏蛋白的主要组分。目前，银杏大多作为干果销售，价格低廉，深加工产品较少，银杏市场需求未能有效拓展，导致产量过剩，供大于求，直接制约了我国银杏产业的进一步持续健康发展。因此，迫切需要研发银杏深加工产品，提高银杏的附加值。
3.食源性生物活性肽被认为是新一代的生物活性调节剂，主要来源于动物蛋白和植物蛋白，具有抗氧化、抗疲劳、调节免疫、降血压、降血脂和降血糖等广泛的生理功能。糖尿病及其并发症是严重危害人类健康的慢性疾病，预计到2045年，全球糖尿病患者将达到约7亿。二肽基肽酶-iv(dipeptidyl peptidase-iv，dpp-iv)是细胞表面的一种丝氨酸蛋白酶，抑制dpp-iv活性有利于控制血糖水平。目前临床上使用的西格列汀、利格列汀和沙格列汀等降血糖药物的作用机制都是靶向抑制dpp-iv活性，但这些药物往往伴随着一定副作用。食源性dpp
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抑制肽由于其无毒副作用、安全性高，且对血糖正常者无降血糖作用，极具开发利用潜力。
4.迄今为止，已鉴定的dpp-iv食品蛋白衍生肽抑制剂尚未显示出与合成药物抑制剂同等的效力，因此需要进一步筛选新型dpp
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抑制肽。银杏肽为银杏蛋白经过单酶或复酶水解后分离所得的低聚肽，已被证实具有抗氧化、降血脂、降血压、降血糖和肝保护等作用。评估了银杏球蛋白作为dpp
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抑制肽来源的潜力，分析结果表明银杏球蛋白中含有大量的dpp
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抑制肽片段，提示银杏球蛋白是dpp
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抑制肽的优质蛋白来源。目前，有关银杏蛋白源dpp
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抑制肽的制备未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有食源性dpp
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抑制肽未显示出与合成药物抑制剂同等效力的问题，提供一种新型的银杏球蛋白源的dpp
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抑制肽的制备方法，该方法制备的银杏肽具有较高的dpp
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抑制活性，且制备工艺高效、快速，过程易于控制。
6.本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
7.一种银杏dpp
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抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
8.(1)将银杏脱壳、去皮后烘干，然后粉碎，过60目筛，得到银杏粉，将银杏粉加入到石油醚中浸泡脱脂，结束后抽滤，干燥，得到脱脂银杏粉；
9.(2)将脱脂银杏粉加入到氯化钠溶液中进行提取，结束后离心收集上清液，往上清液中分批加入硫酸铵至其饱和度达70％～80％，静置过夜后离心，将所得沉淀透析、浓缩、冷冻干燥，得到银杏球蛋白；
10.(3)将银杏球蛋白加入到去离子水中，混合均匀后得到悬浮液，加入蛋白酶进行酶
解，结束后沸水浴灭酶，将得到的产物通过截留分子量为1000da的超滤膜过滤，收集滤液并冷冻干燥，得到银杏dpp
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抑制肽；
11.步骤(3)中，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶中的任意一种。
12.进一步，步骤(2)中，氯化钠溶液的质量浓度为8～12％，脱脂银杏粉和氯化钠溶液的质量体积比为1:15～1:20。
13.进一步，步骤(2)中，所述提取温度为55～60℃，提取时间为2～4h。
14.进一步，步骤(2)中，所述透析采用的是截留分子量为3500da的透析膜，时间为48～72h。
15.进一步，步骤(3)中，银杏球蛋白和去离子水的质量体积比为1:15～1:20。
16.进一步，步骤(3)中，当蛋白酶为胃蛋白酶时，酶解条件为：酶与底物质量比1:50～1:100，酶解温度37℃，酶解ph3.0～3.5，酶解时间2.5～3.5h。
17.进一步，步骤(3)中，当蛋白酶为菠萝蛋白酶时，酶解条件为：酶与底物质量比1:50～1:100，酶解温度50～55℃，酶解ph6.5～7.0，酶解时间3～4h。
18.进一步，步骤(3)中，当蛋白酶为木瓜蛋白酶时，酶解条件为：酶与底物质量比1:50～1:100，酶解温度50～55℃，酶解ph7.5～8.0，酶解时间3～4h。
19.本发明的有益效果：
20.本发明公开了一种银杏dpp
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抑制肽的制备方法，该方法高效、快速，过程易于控制，制备的银杏肽dpp
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抑制活性高(ic
50
值≤0.3mg/ml)、无毒副作用，相对分子质量较小(150～1000da)，易被人体吸收。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作清楚、详细的描述。
22.下述实施例中，涉及的检测方法有：
23.①
dpp
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抑制活性：
24.采用荧光法，以gly-pro-amc为底物，测定银杏肽dpp
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抑制活性。依次将50μl20mmol/l tris-hcl缓冲液(ph8.0)、10μl dpp-iv、10μl抑制剂加入到酶标板，混匀，37℃孵育5min，加入30μl 10mmol/l荧光底物gly-pro-mca溶液启动反应，37℃继续孵育30min，利用酶标仪测定其荧光强度，激发波长380nm，发射波长450nm。
25.dpp-iv抑制率(％)＝(f1－f2)/f1×
100。
26.式中：f1和f2分别为对照组和实验组的荧光强度。
27.ic
50
值为dpp
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抑制率为50％时的银杏肽质量浓度。将银杏肽稀释成7个浓度梯度，测定各浓度梯度的dpp
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抑制率，计算出银杏肽对dpp
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抑制活性的ic
50
值。
28.②
相对分子质量测定：采用高效液相色谱仪测定银杏肽的相对分子质量分布。色谱条件：色谱柱tsk-gel g2000 sw，7.5
×
300mm；流动相乙腈/水/三氟乙酸(10/90/0.1，v/v)；检测波长220nm；流速0.5ml/min；进样量20μl。
29.实施例1
30.一种银杏dpp
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抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
31.(1)将银杏脱壳、去皮后45℃干燥36h，然后粉碎，过60目筛，得到银杏粉，将银杏粉加入到石油醚中浸泡脱脂6h，每20min搅拌一次，结束后抽滤，干燥，得到脱脂银杏粉；
32.(2)以1:15的质量体积比将脱脂银杏粉加入到质量浓度为10％的氯化钠溶液中，60℃水浴提取2h，结束后3000r/min离心20min，收集上清液，往上清液中分批加入硫酸铵至其饱和度达70％，静置过夜后5000r/min离心20min，将所得沉淀采用截留分子量为3500da的透析膜透析72h，浓缩、冷冻干燥，得到银杏球蛋白；考马斯亮蓝法测得银杏蛋白纯度为86.42％。
33.(3)以1:15的质量体积比将银杏球蛋白加入到去离子水中，混合均匀后得到悬浮液，加入胃蛋白酶进行酶解，酶解条件：酶与底物质量比1:50，酶解温度37℃，酶解ph3.0，酶解时间3h；结束后沸水浴灭酶5min，将得到的产物通过截留分子量为1000da的超滤膜过滤，收集滤液并冷冻干燥，得到银杏dpp
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抑制肽。
34.测得制备的银杏dpp
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抑制肽对dpp
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抑制活性的ic
50
值分别为73.12μmol/l；银杏dpp
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抑制肽的相对分子质量分布范围为150～1000da。
35.实施例2
36.步骤(3)中，酶解采用的是菠萝蛋白酶，酶解条件为：酶与底物质量比1:50，酶解温度50℃、酶解ph 6.5，酶解时间4h。其余与实施例1相同。
37.测得制备的银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽对dpp
‑ⅳ
抑制活性的ic
50
值分别为75.15μmol/l；银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽的相对分子质量分布范围为150～1000da。
38.实施例3
39.步骤(3)中，酶解采用的是木瓜蛋白酶，酶解条件为：酶与底物质量比1:50，酶解温度50℃，酶解ph 7.5，酶解时间4h。其余与实施例1相同。
40.测得制备的银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽对dpp
‑ⅳ
抑制活性的ic
50
值分别为78.17μmol/l；银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽的相对分子质量分布范围为150～1000da。
41.实施例4
42.一种银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
43.(1)将银杏脱壳、去皮后45℃干燥36h，然后粉碎，过60目筛，得到银杏粉，将银杏粉加入到石油醚中浸泡脱脂6h，每20min搅拌一次，结束后抽滤，干燥，得到脱脂银杏粉；
44.(2)以1:20的质量体积比将脱脂银杏粉加入到质量浓度为10％的氯化钠溶液中，55℃水浴提取3h，结束后3500r/min离心15min，收集上清液，往上清液中分批加入硫酸铵至其饱和度达80％，静置过夜后5000r/min离心15min，将所得沉淀采用截留分子量为3500da的透析膜透析72h，浓缩、冷冻干燥，得到银杏球蛋白；考马斯亮蓝法测得银杏蛋白纯度为87.34％。
45.(3)以1:20的质量体积比将银杏球蛋白加入到去离子水中，混合均匀后得到悬浮液，加入胃蛋白酶进行酶解，酶解条件：酶与底物质量比1:100，酶解温度37℃，酶解ph3.5，酶解时间3.5h；结束后沸水浴灭酶8min，将得到的产物通过截留分子量为1000da的超滤膜过滤，收集滤液并冷冻干燥，得到银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽。
46.测得制备的银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽对dpp
‑ⅳ
抑制活性的ic
50
值分别为67.36μmol/l；银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽的相对分子质量分布范围为150～1000da。
47.实施例5
48.步骤(3)中，酶解采用的是菠萝蛋白酶，酶解条件为：酶与底物质量比1:100，酶解温度55℃、酶解ph7.0，酶解时间4h。其余与实施例4相同。
49.测得制备的银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽对dpp
‑ⅳ
抑制活性的ic
50
值分别为74.31μmol/l；银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽的相对分子质量分布范围为150～1000da。
50.实施例6
51.步骤(3)中，酶解采用的是木瓜蛋白酶，酶解条件为：酶与底物质量比1:100，酶解温度55℃，酶解ph8.0，酶解时间3.5h。其余与实施例1相同。
52.测得制备的银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽对dpp
‑ⅳ
抑制活性的ic
50
值分别为76.34μmol/l；银杏dpp
‑ⅳ
抑制肽的相对分子质量分布范围为150～1000da。
53.以上所述实施例只是本发明的较佳实例，而没有限制本发明的实施范围。因此，凡是根据本发明内容的实质所作出的等效修改，都应属于在本发明的保护范围内。