一种微量细胞原位微反应器及制备与应用

1.本发明涉及一种微量细胞原位微反应器，可应用于1-100个细胞、微量体液和组织样本的蛋白质高效预处理。


背景技术：

2.传统的基于bottom-up的蛋白质组学样品处理流程通常包括蛋白质的提取、变性、还原、烷基化、脱盐和酶解等，这些操作通常在离线条件下完成，并且需要多步转移，蛋白质样品损失难以避免。此外，大多数蛋白质组学样品处理方法采用去污剂或尿素裂解细胞(j proteome res,2015,14:3403-3408)，由于这些化学物质与质谱不兼容，需在lc-ms分析前将其去除。为了解决上述问题，wisniewski等人开发了滤膜辅助的样品制备(fasp)方法，在单个容器超滤管中进行样品制备，通过离心去除表面活性剂和其他低分子量的污染干扰物。他们通过采用fasp可以从500个hela细胞中鉴定出905种蛋白质(j proteome res,2011,10:3040-3049)，然而，该方法的回收率通常只有50％-80％，因此限制了其在痕量样品处理中的应用。
3.为了解决上述问题，我们制备了一种微量细胞原位微反应器，在开管柱内进行原位的蛋白质组样品预处理，同时实现其它干扰试剂(如裂解试剂、表面活性剂、还原剂等小分子)的快速去除，开管柱的限域效应还有利于提高蛋白质的反应效率，为微量细胞蛋白质组的高效处理与分析提供重要手段。


技术实现要素：

4.本发明涉及一种微量细胞原位微反应器的制备及其应用，通过对毛细管内壁进行硅烷化处理，并通过自由基聚合反应在其表面修饰环氧基团，制备成毛细管开管柱，然后通过共价键合依次修饰聚乙烯亚胺和碘乙酸-n-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化毛细管微反应器。将该微反应器用于1-100个细胞中微量蛋白质组的样品处理，具体处理过程如下：首先，分别将细胞裂解液和细胞混悬液依次通入微反应器内，形成“裂解液-细胞-裂解液“三明治结构。然后，通过超声破碎使微反应器内的细胞裂解；同时，在高温条件下，快速实现蛋白质的变性、还原和烷基化反应，使蛋白共价固定在微反应器的内表面；最后，采用甲醇和碳酸氢铵等溶剂清洗微反应器，以去除表面活性剂、脂和糖类等干扰物质；加入适量蛋白酶，在适当温度下进行酶解。酶解产物可直接进行液相色谱-质谱分析。本发明的优点是原位进行蛋白质组样品处理，有利于减少传统样品处理过程中多步转移导致的样品损失，因此，该固相烷基化开管柱适合于微量样品的蛋白质组预处理。此外，本方法耐受各种表面活性剂和强裂解试剂，具有较好的样品兼容性。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
6.(1)采用内径为100-200μm的带有聚乙酰亚胺涂层的石英毛细管，首先活化毛细管以暴露出其内壁的羟基，依次采用氢氧化钠、盐酸和甲醇对毛细管进行碱洗、酸洗和醇洗，氢氧化钠和盐酸的浓度均为1-2m。
7.(2)对上述毛细管进行硅烷化处理，在其内表面引入双键，进而与甲基丙烯酸单体共聚。采用的硅烷化试剂为3-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷(γ-maps)或乙烯基三甲氧基硅烷(vmts)，浓度体积比为50％-100％。
8.(3)通过自由基聚合反应在毛细管内壁修饰环氧基团：将引发剂、单体、致孔剂均匀分散于溶液中，除气，通入硅烷化处理过的毛细管内，通过引发剂引发聚合，50-60℃反应5-7小时，在毛细管内表面形成涂层结构。聚合溶剂中引发剂和单体的质量比为1:100-1:200，单体和致孔剂的质量比为1:5-1:20。采用的单体为含环氧集团的丙烯基类单体，如甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)；用于引发聚合反应的引发剂包括偶氮二异丁腈(aibn)、偶氮二异庚腈(abvn)中的一种；致孔剂包括正丙醇、丁二醇、正十二醇中的一种或两种以上。
9.(4)在毛细管开管柱表面引入树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺(pei)，进一步通过共价键合的方式在修饰碘乙酸-n-琥珀酰胺酯，具体反应过程为：将pei溶液通入毛细管开管柱中，50-60℃反应4-6小时，待反应完毕后，去除开管柱内残留的pei，并用水冲洗至中性。然后将碘乙酸-n-琥珀酰胺酯溶于甲醇和磷酸缓冲溶液混合体系中，加入修饰pei的毛细管开管柱，25-40℃反应24小时(每隔4-6小时补加一次)，最后用甲醇冲洗并通氮气吹干，即可得到微量细胞原位微反应器。pei的终浓度为10-100mg/ml；碘乙酸-n-琥珀酰胺酯溶液的终浓度为10-100mg/ml，磷酸缓冲溶液与甲醇的体积比为1:5-1:20，其中，磷酸缓冲溶液浓度为0.01-0.1m,ph值为7-9。
10.(5)将上述微量细胞原位微反应器应用于微量细胞蛋白质组样品预处理，具体过程如下：在微反应器内依次通入裂解液、细胞溶液和裂解液，体积均为50-200nl。首先采用pbs缓冲液清洗细胞三次，细胞密度调整为10
4-106cells/ml。裂解液包括表面活性剂如十二烷基硫酸钠(sds)和还原剂三(2-羧乙基)膦(tcep)，sds的质量体积比为0.01％-0.5％，tcep的浓度为25-100mm。4℃超声5-15分钟使细胞完全裂解，之后水浴加热90-95℃反应5-10分钟，快速实现蛋白质的变性、还原和烷基化。然后采用50％甲醇或乙腈清洗，以去除微反应器内残留的裂解液和还原剂，并置换为弱碱性缓冲体系，如碳酸氢铵(abc)或羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)，浓度为25-100mm，ph值为7-9。最后在微反应器内通入蛋白酶，如胰蛋白酶(trypsin)、金黄色葡萄球菌v8蛋白酶(glu-c)、赖氨酰内切酶(lys-c)中的一种或两种以上，上述蛋白酶的加入量为10-100ng，37℃酶解6-12小时，酶解产物保存于-80℃或者直接进行液相色谱-质谱分析。
11.本发明具有如下优点：
12.1、采用自由基聚合反应制备毛细管开管柱，在其表面修饰碘乙酸-n-琥珀酰胺酯，该制备过程容易控制，重复性好；
13.2、采用所制备的微量细胞原位微反应器进行样本处理，可以与各种表面活性剂兼容，提高微量细胞蛋白的提取效率，避免多步转移导致的微量样品损失，提高微量样品处理的回收率；
14.3、微量细胞原位微反应器可实现多步反应的同时进行(包括蛋白质变性、还原和烷基化)，由于毛细管开管柱的限域效应，减小反应体积(纳升)有利于提高样品处理的效率。
附图说明
15.图1微量细胞原位微反应器的制备示意图；
16.图2微量细胞原位微反应器的扫描电镜表征图；
17.图3基于微量细胞原位微反应器的蛋白质原位预处理流程图；
18.图4微量细胞原位微反应器用于100个hela细胞蛋白质组学分析得到的质谱图；
19.图5微量细胞原位微反应器用于10个hela细胞蛋白质组学分析得到的质谱图；
20.图6微量细胞原位微反应器用于1个hela细胞蛋白质组学分析得到的质谱图；
21.图7将微量细胞原位微反应器用于100个hela细胞蛋白质组学的lc-ms/ms分析，在不同反应时间下鉴定到的蛋白和肽段数
具体实施方式
22.实施例1
23.微量细胞原位微反应器的制备
24.1.首先截取3m长的带有聚乙酰亚胺涂层的石英毛细管(内径200μm、外径360μm)，通入1m naoh(8μl/min)冲洗3小时，并用水冲洗至中性；然后采用1m hcl(8μl/min)冲洗2小时，并用水冲洗至中性；最后通入甲醇(8μl/min)冲洗2小时，并通氮气完全吹干。
25.2.将3-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液(浓度体积比为50％)通入上述活化过的毛细管内，充满后用橡胶塞塞住毛细管两开口端，置于50℃烘箱反应24小时，之后通入甲醇清洗1小时，并通氮气完全吹干。
26.3.将偶氮二异丁腈(aibn)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)和正丙醇(质量比为1:100:900)混合并分散均匀，通氮除去其中的氧气，将上述聚合溶液通入硅烷化处理过的毛细管内，充满后用橡胶塞塞住毛细管两开口端，置于60℃水浴锅中反应5小时，在毛细管内表面聚合形成涂层结构，待反应结束后通入甲醇清洗1小时，并通氮气完全吹干。
27.4.将聚乙烯亚胺(pei)溶液(10mg/ml)通入毛细管开管柱内，充满后用橡胶塞塞住毛细管两开口端，置于60℃水浴锅中反应5小时，待反应完毕后，去除开管柱内残留的pei，并用水冲洗至中性，然后通入甲醇冲洗。
28.5.避光配置碘乙酸-n-琥珀酰胺酯(iaa-nhs)溶液(10mg/ml)，称取iaa-nhs(10mg)溶于甲醇(1ml)和磷酸缓冲溶液(200μl，ph＝8)混合体系中，通入pei修饰的毛细管开管柱内，充满后用橡胶塞塞住毛细管两开口端，40℃反应24小时，每隔5小时补加一次碘乙酸-n-琥珀酰胺酯溶液(10mg/ml)，充满后用橡胶塞塞住毛细管两开口端，最后用甲醇冲洗1小时并通氮气吹干，即可得到微量细胞原位微反应器。
29.实施例2
30.微量细胞原位微反应器用于100个hela细胞的蛋白质组样品预处理
31.1.在75cm2培养瓶中培养hela细胞，当细胞生长密度达到80％-90％时(约5
×
106个细胞)，加入0.5ml胰酶消化2min后收集细胞，再加入5ml pbs缓冲液清洗三次，离心5min收集细胞沉淀，将hela细胞重悬于pbs缓冲液中，最终将细胞密度调节为5
×
105cells/ml。
32.2.配置含十二烷基硫酸钠(质量体积(mg/ml)比为0.05％)和还原剂三(2-羧乙基)膦(50mm)作为细胞裂解液。截取5cm长的实施例1的微量细胞原位微反应器，通过高精度注射泵(harvard)向微反应器内依次通入100nl裂解液、200nl细胞溶液(5
×
105cells/ml)和
100nl裂解液，总体积为400nl。在取样过程中避免引入气泡。用橡胶塞塞住微反应器两端。
33.3.将上述微反应器置于微量样品超声破碎仪内，4℃超声5分钟使细胞完全裂解；然后将样品水浴加热90℃反应5分钟，实现蛋白质的快速变性、还原和烷基化。
34.4.将体积浓度50％的甲醇通入微反应器中(50μl)，清洗去除残留的表面活性剂等干扰物，然后通入50mm碳酸氢铵溶液(50μl，ph＝8)清洗；最后通入trypsin和lys-c的混合溶液(50-80ng，质量比为1:1)，用橡胶塞塞住微反应器两端，置于水浴锅内37℃酶解12小时。酶解产物保存于-80℃或者直接进行液相色谱-质谱分析。如图7所示，微量细胞原位微反应器在5分钟内即可实现蛋白质的变性、还原和烷基化，可以从100个hela细胞中鉴定到735种蛋白。
35.实施例3
36.微量细胞原位微反应器用于10个hela细胞的蛋白质组样品预处理
37.1.在75cm2培养瓶中培养hela细胞，当细胞生长密度达到80％-90％时(约5
×
106个细胞)，加入0.5ml胰酶消化2min后收集细胞，再加入5ml pbs缓冲液清洗三次，离心5min收集细胞沉淀，将hela细胞重悬于pbs缓冲液中，最终将细胞密度调节为1
×
105cells/ml。
38.2.配置含十二烷基硫酸钠(质量体积(mg/ml)比为0.05％)和还原剂三(2-羧乙基)膦(50mm)作为细胞裂解液。截取5cm长的实施例1的微量细胞原位微反应器，通过高精度注射泵(harvard)向微反应器内依次通入100nl裂解液、100nl细胞溶液(1
×
105cells/ml)和100nl裂解液，总体积为300nl。在取样过程中避免引入气泡。用橡胶塞塞住微反应器两端。
39.3.将上述微反应器置于微量样品超声破碎仪内，4℃超声5分钟使细胞完全裂解；然后将样品水浴加热90℃反应5分钟，实现蛋白质的快速变性、还原和烷基化。
40.4.将体积浓度50％的甲醇通入微反应器中(50μl)，清洗去除残留的表面活性剂等干扰物，然后通入50mm碳酸氢铵溶液(50μl，ph＝8)清洗；最后通入trypsin和lys-c的混合溶液(40-60ng，质量比为1:1)，用橡胶塞塞住微反应器两端，置于水浴锅内37℃酶解12小时。酶解产物直接进行液相色谱-质谱分析，得到的质谱图如图5所示。
41.实施例4
42.微量细胞原位微反应器用于1个hela细胞的蛋白质组样品预处理
43.1.在75cm2培养瓶中培养hela细胞，当细胞生长密度达到80％-90％时(约5
×
106个细胞)，加入0.5ml胰酶消化2min后收集细胞，再加入5ml pbs缓冲液清洗三次，离心5min收集细胞沉淀，将hela细胞重悬于pbs缓冲液中，最终将细胞密度调节为1
×
103cells/ml。
44.2.配置十二烷基硫酸钠(质量体积(mg/ml)比为0.05％)和还原剂三(2-羧乙基)膦(50mm)作为细胞裂解液。截取5cm长的实施例1的微量细胞原位微反应器，通过高精度注射泵(harvard)向微反应器内通入50nl裂解液，然后在显微镜下抽取1个hela细胞，最后再抽取50nl裂解液，总体积为120-300nl。在取样过程中避免引入气泡。用橡胶塞塞住微反应器两端。
45.3.将上述微反应器置于微量样品超声破碎仪内，4℃超声5分钟使细胞完全裂解；然后将样品水浴加热90℃反应5分钟，实现蛋白质的快速变性、还原和烷基化。
46.4.将体积浓度50％的甲醇通入微反应器中(50μl)，清洗去除残留的表面活性剂等干扰物，然后通入50mm碳酸氢铵溶液(50μl，ph＝8)清洗；最后通入trypsin和lys-c的混合溶液(20-50ng，质量比为1:1)，用橡胶塞塞住微反应器两端，置于水浴锅内37℃酶解12小
时。酶解产物直接进行液相色谱-质谱分析，得到的质谱图如图6所示。