一种微量细胞原位微反应器及制备与应用

技术特征：
1.一种微量细胞原位微反应器的制备方法，其特征在于：通过对毛细管内壁进行硅烷化处理，并通过自由基聚合反应在其表面修饰环氧基团，制备成毛细管开管柱，然后通过共价键合依次修饰聚乙烯亚胺和碘乙酸-n-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化毛细管微反应器。2.按照权利要求1所述的微量细胞原位微反应器的制备方法，其特征在于：在毛细管内壁进行自由基聚合反应之前，先活化毛细管以暴露出其表面的羟基，然后进行硅烷化处理，在毛细管内表面引入双键，进而与甲基丙烯酸单体共聚；采用的硅烷化试剂种类为3-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷(γ-maps)或乙烯基三甲氧基硅烷(vmts)中的两种或一种，浓度体积比为50％-100％；毛细管活化过程依次采用氢氧化钠、盐酸和甲醇对毛细管进行碱洗、酸洗和醇洗，氢氧化钠和盐酸的浓度均为1-2m。3.按照权利要求1所述的微量细胞原位微反应器的制备方法，其特征在于：通过自由基聚合反应在毛细管内壁修饰环氧基团，其中，采用的毛细管内径为100-200μm；单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)，引发剂为偶氮二异丁腈(aibn)、偶氮二异庚腈(abvn)中的两种或一种，致孔剂类为正丙醇、丁二醇、正十二醇中的一种或两种以上，聚引发剂和单体的质量比为1:100-1:200，单体和致孔剂的质量比为1:5-1:20，反应温度为50-60℃，反应时间为5-7小时。4.按照权利要求1所述的微量细胞原位微反应器的制备方法，其特征在于：微反应器内表面修饰环氧基团后，进一步引入树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺(pei)，然后通过共价键合的方式修饰碘乙酸-n-琥珀酰胺酯，其中，所采用pei溶液的终浓度为10-100mg/ml；碘乙酸-n-琥珀酰胺酯溶于甲醇和磷酸缓冲溶液混合体系，磷酸缓冲溶液与甲醇体积比为1:5-1:20；碘乙酸-n-琥珀酰胺酯终浓度为10-100mg/ml，磷酸缓冲溶液浓度为0.01-0.1m,ph值为7-9；反应温度为25-40℃，反应时间为12-24小时。5.一种权利要求1-4任一所述制备方法获得的微量细胞原位微反应器。6.一种权利要求5所述的微量细胞原位微反应器的应用，其特征在于：可应用于微量细胞、体液、组织中一种或二种以上的蛋白质样品预处理，所述微量细胞是指用于1-100个细胞的蛋白质样品处理。7.按照权利要求6所述的微量细胞原位微反应器的应用，其特征在于：通过蛋白质的巯基选择性反应，将蛋白质固定在固相烷基化毛细管微反应器内，从而进行原位的微量蛋白质样品预处理。8.按照权利要求6或7所述的微量细胞原位微反应器的应用，其特征在于：分别将裂解液和细胞混悬液依次通入微反应器内，形成“裂解液-细胞-裂解液”三明治结构；然后，通过超声破碎使微反应器内的细胞裂解；同时，在90-95℃、5-10分钟内快速实现蛋白质的变性、还原和烷基化反应，使蛋白共价固定在微反应器的内表面；最后，采用甲醇、乙腈和碳酸氢铵等一种或二种以上溶剂清洗微反应器，以去除表面活性剂、脂和糖类等干扰物质；加入蛋白酶进行酶解；酶解产物可直接进行液相色谱-质谱分析。

技术总结
本发明涉及一种微量细胞原位微反应器的制备及其应用，通过对毛细管内壁进行硅烷化处理，并通过自由基聚合反应在其表面修饰环氧基团，制备成毛细管开管柱，然后通过共价键合依次修饰聚乙烯亚胺和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化毛细管微反应器。本发明的优点是原位进行蛋白质组样品处理，有利于减少传统样品处理过程中多步转移导致的样品损失，因此，该固相烷基化开管柱适合于微量样品的蛋白质组预处理。此外，本方法耐受各种表面活性剂和强裂解试剂，具有较好的样品兼容性。具有较好的样品兼容性。具有较好的样品兼容性。


技术研发人员：张丽华 贺映云 袁辉明 梁玉 刘欣欣 杨开广 张玉奎
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：2021.06.07
技术公布日：2022/12/22