一种用于细胞三维培养的温敏纳米凝胶的制备方法

1.本发明涉及细胞三维培养技术领域，具体地，涉及一种用于细胞三维培养的温敏纳米凝胶的制备方法。


背景技术：

2.目前，大部分的细胞培养研究都在二维表面进行，如微孔板、组织培养瓶、培养皿等，使用二维培养的特点是简单、高效、快捷、细胞存活率高。在二维培养体系中，贴壁细胞在固体培养板表面贴壁呈单层生长，以低于50％的表面积与培养板底面接触，而其余的表面积与液态培养基接触，仅有很少部分与其他细胞或基质接触；缺乏体内微环境下细胞-细胞间、细胞-细胞外基质间的动态相互作用，不能准确反映体内细胞真实的生长情况。
3.在体内，几乎所有的组织细胞都生活在细胞外基质(extracellular matrix,ecm)中，这些ecm包括了许多复杂的三维纤维网络，可以提供复杂的生物及物理信号。但传统的二维细胞培养所提供的环境不同于体内细胞生长的环境，难以用其去模拟真实体内生理组织中细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。细胞三维培养技术很好地弥补了这些缺点，三维培养条件下的细胞几乎100％的表面积都与其他细胞或基质接触，所培养的细胞具有特征性的生物信号转导，可以影响细胞增殖、黏附、迁移和基因表达等功能。
4.根据最新研究，在二维培养和三维培养的不同条件下，许多细胞生物学行为将产生重大的变化，包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、基因表达和药物代谢方面。三维细胞培养所使用的基质，克服了传统二维培养的限制，这些基质往往都是多孔结构，可以支持细胞在体外以更接近体内真实环境下进行生长、繁殖和分化。
5.为了更好地模拟体内细胞的生长环境，近年来，细胞三维培养技术得到了发展。在众多用于细胞三维培养的材料中，水凝胶材料因其具有保水性高的优势，是模拟ecm的理想材料。
6.纳米凝胶是纳米级的水凝胶粒子，兼具水凝胶和纳米粒子的特性。聚异丙基丙烯酰胺(pnipam)纳米凝胶具有温度敏感性。25度下pnipam纳米凝胶呈溶胀状态；37度下pnipam纳米凝胶去溶胀，体积发生收缩。常温下pnipam纳米凝胶可均一地分散于水中，形成具有流动性的pnipam纳米凝胶悬浮液。该悬浮液可与细胞悬液共混，形成细胞/纳米凝胶混合液。当温度升至37度后，该混合液中的纳米凝胶粒子之间因pnipam分子之间的相互缠绕而发生交联，宏观表现为混合液转化为固态水凝胶支架，细胞被包埋于该支架内，从而实现细胞的三维培养。
7.然而，纯pnipam所形成的水凝胶也存在缺陷。首先，pnipam水凝胶在37度下会发生持续的体积收缩，阻碍细胞的迁移、生长；其次，pnipam属于合成水凝胶，其生物相容性较低。


技术实现要素：

8.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于细胞三位培养的温
敏纳米凝胶的制备方法。
9.本发明的第一目的是提供一种温敏纳米凝胶的制备方法。
10.本发明的第二目的是提供上述制备方法制备得到的温敏纳米凝胶。
11.本发明的第三目的是提供上述温敏纳米凝胶在细胞三维培养中的应用。
12.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
13.一种温敏纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：
14.s1.将异丙基丙烯酰胺(nipam)、n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺(bis)和引发剂在去离子水中混合得到混合溶液1；所述异丙基丙烯酰胺、n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺和引发剂的摩尔比为100：2～4：1；
15.s2.向步骤s1得到的混合溶液1中加入明胶和十二烷基硫酸钠(sds)溶液，除氧，得到混合溶液2；所述明胶与混合溶液1中的异丙基丙烯酰胺的质量比为0～1：1；
16.s3.步骤s2得到的混合溶液2调节温度至65～75℃，充分反应后，降温至30～35℃，纯化，冷冻干燥得到纳米凝胶粉末，即温敏纳米凝胶。
17.优选地，步骤s1中所述异丙基丙烯酰胺、n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺和引发剂的摩尔比为100：4：1。
18.优选地，步骤s1中所述引发剂为过硫酸盐。
19.更有选地，步骤s1中所述引发剂为过硫酸钾或过硫酸铵。
20.进一步优选地，步骤s1中所述引发剂为过硫酸钾。
21.优选地，步骤s2中所述明胶和混合溶液1中的异丙基丙烯酰胺的质量比为0.5～1：1。
22.更优选地，所述明胶和混合溶液1中的异丙基丙烯酰胺的质量比为1：1。
23.优选地，步骤s3中所述调节温度至65～75℃为调节温度至75℃。
24.优选地，步骤s3中所述充分反应的时间为1h。
25.优选地，步骤s3中所述降温至30～35℃为降温至30℃。
26.本发明还请求保护上述任一所述制备方法制备得到的温敏纳米凝胶。
27.本发明还请求保护上述温敏纳米凝胶在细胞三维培养中的应用。
28.优选地，所述温敏纳米凝胶用于细胞三维培养时，需要先将温敏纳米凝胶溶于ph＝7～7.4的pbs溶液中得到纳米凝胶悬浮液。
29.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
30.本发明提供了一种温敏纳米凝胶的制备方法，所述制备方法简单便捷，将明胶引入纳米凝胶的合成中，通过自由基沉淀聚合法制备得到具有互穿聚合物网络(ipn)结构的温敏纳米凝胶。本发明所述制备方法制备得到的温敏纳米凝胶具有互穿聚合物网络结构，相较于纯pnipam纳米凝胶，其热稳定性显著提高，在37℃下体积收缩程度明显减缓，且其生物相容性大大提高。本发明所述的温敏纳米凝胶(纳米凝胶悬浮液)在常温下可以与细胞悬液均匀共混形成混合液，在温度上升至37℃的过程中，混合液逐渐转化为固态水凝胶支架，从而将细胞包埋于该支架内，以此实现细胞的三维培养。在温度从37度降至25度的过程中，水凝胶支架逐渐解聚最终恢复成具有流动性的混合液，从而实现细胞的释放，可以有效避免消化细胞所用的胰酶对细胞活性的损害，实现细胞的无酶传代和收集。
附图说明
31.图1为p-g 1：1纳米凝胶在25℃和37℃时的粒径分布图；
32.图2为p-g 1：1纳米凝胶悬浮液的原位凝胶化示意图；a：p-g 1：1纳米凝胶悬浮液在25℃时的示意图；b：p-g 1：1纳米凝胶悬浮液在37℃时的原位凝胶化示意图；c：p-g1：1纳米凝胶在37℃下孵育24h后的形态图；
33.图3为hela细胞从水凝胶中释放后的存活情况；
34.图4为固态水凝胶在37℃下孵育24h后的形貌图；a：p-g 1：0.5固态水凝胶的形貌图；b：pni固态水凝胶悬浮液的形貌图；
35.图5为hela细胞在不同水凝胶中的生长趋势图。
具体实施方式
36.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
37.实施例1p-g 1：1纳米凝胶悬浮液的的原位凝胶化
38.1、实验方法
39.(1)p-g 1：1纳米凝胶粉末的制备：
40.将1.13g的异丙基丙烯酰胺(nipam)、0.0616g的n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺(bis)、0.027g的过硫酸钾(kps)和35ml的去离子水在圆底烧瓶中混合得到混合溶液1。
41.将1.13g的明胶颗粒加入10ml的去离子水中充分溶解得到明胶溶液
42.将0.0335g的十二烷基硫酸钠(sds)加入5ml的去离子水中充分溶解后和明胶溶液一起加入混合溶液1中，得到混合溶液2，在40℃下向混合溶液2中通氮气40min，磁力搅拌至完全溶解。
43.将含有混合溶液2的圆底烧瓶置于75℃水浴中，待混合溶液2的温度升高至75℃后，反应1h。反应结束后，将圆底烧瓶浸没至冰水中，带混合溶液的温度降至30℃以终止反应，得到反应液。
44.向反应液中加入等体积的去离子水，将烧瓶中所有液体倒入截留量为3500的透析袋中并在30℃下透析7天，透析结束后经过冷冻干燥形成p-g 1：1纳米凝胶粉末。
45.采用粒径仪测定不同温度下的p-g 1：1纳米凝胶的粒径。
46.(2)p-g 1：1水凝胶的制备
47.将步骤(1)得到的p-g 1：1纳米凝胶粉末溶于pbs(ph＝7.4)中，得到纳米凝胶悬浮液，其中p-g 1：1纳米凝胶的浓度为50mg/ml。
48.分别将p-g 1：1纳米凝胶悬浮液置于37℃和25℃环境下观察p-g 1：1纳米凝胶悬浮液的形态。
49.将纳米凝胶悬浮液置于37℃恒温水浴箱中孵育一段5min，孵育结束后对其进行观察。
50.将p-g 1：1纳米凝胶悬浮液在37℃孵育24h，孵育结束后对其进行观察。
51.2、实验结果
52.制备得到的温敏纳米凝胶的粒径分布如图1所示，结果显示：p-g 1：1纳米凝胶在25℃和37℃之间，其粒径分布存在着显著的差异，当温度从25℃上升至37℃后，p-g 1：1纳米凝胶的粒径发生一定程度的减小，说明其具有温度敏感性。
53.p-g 1：1纳米凝胶悬浮液的原位凝胶化测试结果如图2所示。图2a和图2b结果显示：25℃下p-g 1：1纳米凝胶粉末可溶于pbs形成液态的纳米凝胶悬浮液，37℃下纳米凝胶悬浮液就转化为固态的水凝胶。结果说明：当温度从25℃升至37℃后，液态的p-g 1：1纳米凝胶悬浮液转化为固态的水凝胶支架，p-g 1：1纳米凝胶悬浮液具有良好的温度敏感性；图2c显示：在37℃孵育24h后，水凝胶的体积出现一定程度的收缩，同时有水分析出。
54.实施例2p-g 1：1纳米凝胶用于细胞三维培养
55.1、实验方法
56.将hela细胞悬液和实施例1中的p-g 1：1纳米凝胶悬浮液按照体积比＝1：1混合得到细胞/纳米凝胶混合液，其中细胞密度为3
×
105个/ml，p-g 1：1纳米凝胶的浓度为50mg/ml。将混合液转移至37℃、5％co2的细胞培养箱中使其发生原位凝胶化实现细胞接种，并记为day0。
57.分别测定hela细胞在day1、day3和day5的增殖情况。
58.在day5降温使p-g 1：1水凝胶解聚释放hela细胞，将hela细胞用calcein-am染色并观察。
59.2、实验结果
60.染色后的hela细胞的观察结果如图3所示，结果显示：hela细胞活性良好，说明p-g1：1纳米凝胶可应用于细胞的三维培养。
61.实施例3p-g 1：0.5纳米凝胶悬浮液的原位凝胶化
62.1、实验方法
63.(1)p-g 1：0.5纳米凝胶粉末的制备
64.p-g 1：0.5纳米凝胶的制备方法同实施例1步骤(1)中p-g 1：1纳米凝胶的制备方法的区别在于：将0.565g明胶溶解于10ml去离子水中充分溶解得到明胶溶液。
65.其余步骤同实施例1步骤(1)中步骤相同，得到p-g 1：0.5纳米凝胶粉末。
66.(2)p-g 1：0.5水凝胶的制备
67.以pbs(ph 7.4)为溶剂，将步骤(1)得到的p-g 1：0.5纳米凝胶粉末溶于其中，配制得到浓度为50mg/ml的p-g 1：0.5纳米凝胶悬浮液。将p-g 1：0.5纳米凝胶悬浮液置于37℃恒温水浴箱中孵育24h，得到p-g 1：0.5固态水凝胶。
68.2、实验结果
69.p-g 1：0.5固态水凝胶的观察结果如图4a所示，结果显示：结合实施例1制备得到的固态水凝胶支架(图2c)，可以看出水凝胶的热稳定性随着纳米凝胶中明胶含量的增大而提高，具体表现为在37℃条件下，纳米凝胶的体积皱缩被抑制，明胶添加量越多其体积皱缩程度越小。
70.实施例4pni纳米凝胶(pnipam)的原位凝胶化
71.1、实验方法
72.(1)pni纳米凝胶的制备
73.将1.13g的异丙基丙烯酰胺(nipam)、0.0616g的n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺(bis)、
0.027g的过硫酸钾(kps)和45ml的去离子水在圆底烧瓶中混合得到混合溶液1。
74.将0.0335g的十二烷基硫酸钠(sds)加入5ml的去离子水中充分溶解后，将sds溶液加入至混合溶液1中，得到混合溶液2。
75.在25℃下向混合溶液2中通入氮气40min，磁力搅拌至完全溶解。将含有混合溶液2的圆底烧瓶置于75℃水浴中，待混合溶液2的温度升高至75℃后，反应1h。
76.待反应结束后，将圆底烧瓶浸没至冰水中待混合溶液2的温度降低至25℃终止反应。接着向圆底烧瓶中加入与混合溶液2同等体积的去离子水，接着将圆底烧瓶中的所有液体倒入截留量为3500的透析袋中并在25℃下透析7天，透析结束后经过冷冻干燥形成pni纳米凝胶粉末。
77.(2)pni水凝胶的制备
78.以pbs(ph 7.4)为溶剂，将步骤(1)得到的pni纳米凝胶粉末溶于其中，配制得到浓度为50mg/ml的pni纳米凝胶悬浮液。将pni纳米凝胶悬浮液置于37℃恒温水浴箱中孵育24h，得到pni固态水凝胶。
79.2、实验结果
80.pni固态水凝胶的观察结果如图4b所示；结果显示：结合实施例1制备得到的固态水凝胶支架(图2c)，可以看出固态水凝胶的热稳定性随着固态水凝胶中明胶含量的增大而提高，具体表现为在37℃条件下，固态水凝胶的体积皱缩被抑制，明胶添加量越多其体积皱缩程度越小。
81.实施例5不同的温敏纳米凝胶用于细胞三维培养
82.1、实验方法
83.分别用实施例3制备得到的p-g 1：0.5纳米凝胶、实施例4制备得到的pni纳米凝胶以及二维培养技术(tcp)培养hela细胞，并记录细胞的增殖情况，与实施例3中细胞增殖情况汇总。
84.具体培养记录方法参照实施例2中方法。
85.2、实验结果
86.不同温敏性水凝胶培养hela细胞的增殖情况如图5所示，结果显示：hela细胞在p-g1:1水凝胶中增殖最优，说明该水凝胶支架对hela细胞的增殖起到了良好的促进作用，并且只有实施例1所述条件制备得到的纳米凝胶的促进效果最好。
87.对比例1不同配方的纳米凝胶的制备
88.1、实验方法
89.(1)p-g 1：1.5纳米凝胶的制备
90.p-g 1：1.5纳米凝胶的制备方法同实施例1步骤(1)中p-g 1：1纳米凝胶的制备方法的区别在于：将1.695g明胶溶解于10ml去离子水中充分溶解得到明胶溶液。
91.其余步骤同实施例1步骤(1)中步骤相同。
92.无法制备得到纳米凝胶。
93.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护
范围之内。