水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂及其制备方法与流程

1.本发明属于饮用水检测技术领域，具体来说涉及一种水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂及其制备方法。


背景技术：

2.产气荚膜梭状芽孢杆菌，为梭状芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌；广泛存在于空气、土壤、垃圾、污水、动物和人的粪便里，通过污染水源可通过饮水引起人畜感染；产气荚膜梭状芽孢杆菌能产生多种外毒素可引起人坏死性肠炎，破坏血管内皮细胞；此菌有芽孢，污染饮用水后存活较长时间，对氯等消毒剂有较强的抵抗力，在饮用水中检出产气荚膜梭状芽孢杆菌除了能说明饮用水曾经被粪便污染，还指示该饮用水能否可以继续饮用。因此产气荚膜梭状芽孢杆菌作为饮用水是否被粪便污染的一个重要指标菌。我国现行《饮用天然矿泉水》(gb8537
‑‑
2008)规定：产气荚膜梭状芽孢杆菌在饮用水中不得检出；目前我国对于水中产气荚膜梭状芽孢杆菌的检测方法，主要为细菌培养方法，即膜过滤法；使用培养基将检测水样中通过营养物经过36℃
±
1℃培养，24小时初培养，转移培养基再二次培养24小时后再通过生化鉴定实验得出结果。该方法属于微生物检测的传统方法，需要在实验前期做大量的培养基配置工作，检测场所需要达到无菌环境实验环境要求；目前已经不能满足于当前我国的对公共卫生安全的检测要求，和应对当前公共卫生安全突发的复杂性。因此如何开发一种通过酶底物方法，利用4-甲基伞形酮-β-d-半乳糖苷酶作为指示剂，当酶底物被产气荚膜梭状芽孢杆菌代谢时，经过36℃培养24小时后，样品在366nm波长紫外灯下，产生蓝色荧光。该方法主要针对水中的产气荚膜梭状芽孢杆菌进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度，减少人为误差，缩短检测时间是本领域技术人员需要研究的方向。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定，其能够针对水中的产气荚膜梭状芽孢杆菌进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度、减少人为误差，缩短检测时间。
4.其采用的技术方案如下：
5.一种水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂，其包括以下重量份的组分：14.8～16.8份的ph调节剂；0.25～0.45份的指示剂；1.0～1.8份的抑制剂；5.6～6.4份的生产剂。其中，所述生产剂由1.7～1.9份的酵母粉、1.5～1.7份的蛋白胨、1.9～2.1份的l-精氨酸盐酸盐、0.5～0.7份的葡萄糖构成。
6.优选的是，上述水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂中：所述ph调节剂采用9～10份的氯化钠和5.8～6.8份的无水磷酸氢二钠。
7.更优选的是，上述水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂中：所述指示剂由0.25～0.45份的4-甲基伞形酮-β-d-半乳糖苷酶构成。
8.更优选的是，上述水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂中：所述抑制剂由
0.6～0.8份的无水硫酸镁、0.2～0.4份的无水硫酸钠、0.1～0.3份的无水磷酸氢二钠和0.1～0.3份的无水硫酸锰构成。
9.本发明还公开了一种制备上述水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂的制备方法。
10.其包括如下步骤：
11.s1：分别将ph调节剂和指示剂加热至58℃、直至ph调节剂和指示剂中的水分分别小于10％；
12.s2：将s1所得ph调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于80目；
13.s3：将s2所得ph调节剂和指示剂搅拌混匀、得ph调节剂和指示剂的混合粉末；
14.s4：对s3所得混合粉末中投入抑制剂、生产剂、持续搅拌2.5小时，制得水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂干粉型成品。
15.优选的是，上述步骤s2中ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目。
16.优选的是，所述ph调节剂采用氯化钠和磷酸氢二钾；所述指示剂由4-甲基伞形酮-β-d-半乳糖苷酶构成；所述抑制剂由无水硫酸钠、无水硫酸钠、无水磷酸氢二钠和无水硫酸锰构成，所述生产剂由酵母粉、蛋白胨、l-精氨酸盐酸盐和葡萄糖构成。
17.更优选的是，所述ph调节剂采用9～10份的氯化钠和5.8～6.8份的无水磷酸氢二钠，所述指示剂由0.25～0.45份的4-甲基伞形酮-β-d-半乳糖苷酶构成，所述抑制剂由0.6～0.8份的无水硫酸镁、0.2～0.4份的无水硫酸钠、0.1～0.3份的无水磷酸氢二钠和0.1～0.3份的无水硫酸锰构成，所述生产剂由1.7～1.9份的酵母粉、1.5～1.7份的蛋白胨、1.9～2.1份的l-精氨酸盐酸盐和0.5～0.7份的葡萄糖构成。
18.最优选的是，所述ph调节剂采用9.5份的氯化钠和6.3份的无水磷酸氢二钠，所述指示剂由0.35份的4-甲基伞形酮-β-d-半乳糖苷酶构成，所述抑制剂由0.7份的无水硫酸镁、0.3份的无水硫酸钠、0.2份的无水磷酸氢二钠和0.2份的无水硫酸锰构成，所述生产剂由1.8份的酵母粉、1.6份的蛋白胨、2份的l-精氨酸盐酸盐和0.6份的葡萄糖构成。
19.相对于现有技术，本发明能够对饮用水、自来水、污水中的产气荚膜梭状芽孢杆菌实现快速检测。可配合市面上根据的51孔、97定量盘和mpn表格使用，可达到24小时定性定量的检测结果，不但提高了检测效率，减少了人工成本而且还降低了使用人员和环境的污染。此外，本产品可在121℃灭菌后按企业要求进行废弃处理。相对于现有产品减少了企业的环保成本。
20.与现有技术相比，本发明能够有效降低使用人员和环境的污染，针对水中的产气荚膜梭状芽孢杆菌进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度。
具体实施方式
21.为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将结合各个实施例作进一步描述。
22.实施例1：
23.一种水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂，其原料包括组分：
24.9份的氯化钠,5.8份无水磷酸氢二钠，0.25份的4-甲基伞形酮-β-d-半乳糖苷酶，0.6份的无水硫酸镁，0.2份的无水硫酸钠，0.1份的无水磷酸氢二钠，0.1份的无水硫酸锰，
1.7份酵母粉，1.5份的蛋白胨，1.9份的l-精氨酸盐酸盐，0.5份的葡萄糖。
25.其制备过程如下：
26.s1：分别将ph调节剂和指示剂加热至58℃、直至ph调节剂和指示剂中的水分分别小于10％；
27.s2：将s1所得ph调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于80目；
28.s3：将s2所得ph调节剂和指示剂搅拌混匀、得ph调节剂和指示剂的混合粉末；
29.s4：对s3所得混合粉末中投入抑制剂、生产剂、持续搅拌2.5小时，随后控制在40℃以下停机放料、制得水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂干粉型成品。
30.对比例1
31.取1.5份的实施例1成品投入100ml水样中进行检测。同时通过产气荚膜梭状芽孢杆菌阳性定量菌株和酶底物法和膜过滤法进行对比，对比实验检测结果如表1所示：
[0032][0033]
[0034]
表1
[0035]
基于上述对比实验证明，采用实施例1所提供的水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂，在对产气荚膜梭状芽孢杆菌阳性定量菌株进行测试时，测试结果在36℃
±
1℃培养18小时生长达到顶峰值并且一直保持至48小时未有变化，而滤膜法在36℃
±
1℃培养24小时为成长期在48小时候达到峰值，测试结果均符合产气荚膜梭状芽孢杆菌阳性定量菌株的95％置信区间，通过对比可得出结论，水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法其灵敏度更高，检测结果更贴近事实。
[0036]
实施例2：
[0037]
一种水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂，其原料包括组分：
[0038]
9.5份的氯化钠,6.3份无水磷酸氢二钠，0.35份的4-甲基伞形酮-β-d-半乳糖苷酶，0.7份的无水硫酸镁，0.3份的无水硫酸钠，0.2份的无水磷酸氢二钠，0.2份的硫酸锰，1.8份酵母粉，1.6份的蛋白胨，2份的l-精氨酸盐酸盐，0.6份的葡萄糖。
[0039]
其制备过程如下：
[0040]
s1：分别将ph调节剂和指示剂加热至58℃、直至ph调节剂和指示剂中的水分分别小于8％；
[0041]
s2：将s1所得ph调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于70目；
[0042]
s3：将s2所得ph调节剂和指示剂搅拌混匀、得ph调节剂和指示剂的混合粉末；
[0043]
s4：对s3所得混合粉末中投入抑制剂、蛋白胨持续搅拌2.5小时，随后控制在35℃以下停机放料、制得水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂干粉型成品。
[0044]
对比例2
[0045]
取1.5份的实施例2成品投入100ml水样中进行检测。同时通过产气荚膜梭状芽孢杆菌阳性定量菌株和酶底物法和膜过滤法进行对比，对比实验检测结果如表2所示：
[0046][0047]
表2
[0048]
基于上述对比实验证明，采用实施例2所提供的水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂，在对定量阳性菌株进行测试时，测试结果在36℃
±
1℃培养18小时生长达到顶峰值并且一直保持至48小时未有变化，而滤膜法在36℃
±
1℃培养24小时为成长期在48小时候达到峰值，测试结果结果均符合产气荚膜梭状芽孢杆菌阳性定量菌株的95％置信区间，通过对比可得出结论，水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法其灵敏度更高，检测结果更贴近事实。
[0049]
实施例3：
[0050]
一种水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂，其原料包括组分：
[0051]
10份的氯化钠,6.8份无水磷酸氢二钠，0.45份的4-甲基伞形酮-β-d-半乳糖苷酶，0.8份的无水硫酸镁，0.4份的无水硫酸钠，0.3份的无水磷酸氢二钠，0.3份的无水硫酸锰，1.9份酵母粉，1.7份的蛋白胨，2.1份的l-精氨酸盐酸盐，0.7份的葡萄糖。
[0052]
其制备过程如下：
[0053]
s1：分别将ph调节剂和指示剂加热至58℃、直至ph调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
[0054]
s2：将s1所得ph调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于65目；
[0055]
s3：将s2所得ph调节剂和指示剂搅拌混匀、得ph调节剂和指示剂的混合粉末；
[0056]
s4：对s3所得混合粉末中投入抑制剂、蛋白胨、持续搅拌2.5小时，随后控制在40℃以下停机放料、制得水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂干粉型成品。
[0057]
对比例3
[0058]
取1.5份的实施例3成品投入100ml水样中进行检测。同时通过产气荚膜梭状芽孢杆菌阳性定量菌株和酶底物法和膜过滤法进行对比，对比实验检测结果如表3所示：
[0059][0060][0061]
表3
[0062]
基于上述比对实验证明，采用实施例3所提供的水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法测定剂，在对定量阳性菌株进行测试时，测试结果在36℃
±
1℃培养18小时生长达到顶峰值并且一直保持至48小时未有变化，而滤膜法在36℃
±
1℃培养24小时为成长期在48小时候达到峰值，测试结果结果均符合产气荚膜梭状芽孢杆菌阳性定量菌株的95％置信区间，通过对比可得出结论，水中产气荚膜梭状芽孢杆菌酶底物法其灵敏度更高，检测结果更贴近事实。
[0063]
以上所述，仅为本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书的保护范围为准。
[0064]
终上所述，计量按最低(实例1)、中间值(实例2)、最高(实例3)分别进行试验比对得出结论，计量在添加值在实例2中表现最好，超过中间值到最高值(实例3)对结果影响不大，试验效率上没有明显提升。
[0065]
以上所述，仅为本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书的保护范围为准。