一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的杏仁小分子肽及其应用

一种抑制
α-葡萄糖苷酶活性的杏仁小分子肽及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的杏仁小分子肽及其应用。


背景技术：

2.糖尿病以高血糖为特征的代谢性疾病，血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或者生物作用受损，或者二者兼有引起的，糖尿病已经成为严重威胁人类健康的慢性疾病之一，由于糖尿病所引起的冠心病、肾病、视网膜病及神经病变等是造成病人致死、致残的主要原因。
3.葡萄糖苷酶抑制剂是糖尿病患者常用的一类降低血糖药物，葡萄糖苷酶抑制剂可以抑制小肠葡萄糖苷酶对食物中淀粉、蔗糖等的吸收，延迟碳水化合物的吸收，从而起到降低餐后血糖的作用。现有的抑制葡萄糖苷酶活性的抑制剂药物主要有阿卡波糖(acrbose)、伏格列波糖(voglibose)和米格列醇(midlitol)，但是这些药物长期服用会造成胃胀气、腹泻等副作用。
4.杏仁具有降血糖、降血脂、降血压、抗癌等生物活性。经常吃杏仁可以起到降低胆固醇、促进心血管健康，还可以控制血糖水平，现已有报道杏仁多肽具有降血糖功效，但是能够引起血糖下降的路径很多，而杏仁多肽种类成千上万种，并不是任何杏仁多肽都具备该功能。因而寻找能够降血糖的杏仁肽，并明确其作用机制尤其重要，为后续降血糖药物及保健品的研发奠定基础。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种杏仁小分子肽，能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，具有优异的降血糖功能。
6.本发明目的通过如下技术方案实现：
7.一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的杏仁小分子肽，其特征在于：其氨基酸序列为脯氨酸-精氨酸(pr)，结构式为
8.采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶k作为复合酶水解杏仁蛋白，分离出上述小分子肽pr，通过分子对接，发现其与α-葡萄糖苷酶具有9个结合位点，具有优异的结合力。在体外对α-葡萄糖苷酶具有优异的抑制能力，其ic
50
为19.79
±
0.006μm。
9.为了进一步确定对于α-葡萄糖苷酶的抑制作用，是小分子肽pr带来的作用，通过人工合成手段，制备出高纯度的pr，具体合成过程由中国西安纳威生物技术有限公司完成，合成的pr小分子肽纯度为95％以上，pr的分子量为271.05。
10.上述杏仁小分子肽的应用，具体在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用。
11.发现pr可激活高糖诱导的ir hepg2细胞的irs-1/pi3k/akt和ampk信号通路。在ir hepg2细胞中，100μmol/l的pr肽通过促进glut4的表达和转运而增加葡萄糖的摄取和转运。通过调价糖原合成直接相关的p-gsk3β(ser9)、gsk3β和gs的蛋白表达，影响糖原合成。
12.本发明具有如下技术效果：
13.本发明公开的一种杏仁小分子肽脯氨酸-精氨酸(pr)，可以显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其体外α-葡萄糖苷酶抑制能力ic
50
值为19.79
±
0.006μm，此外，该小分子肽与α-葡萄糖苷酶具有优异的结合位点，使得结合程度较高，更容易有效发挥其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，可用于降血糖方面的应用。
附图说明
14.图1：各小分子肽与α-葡萄糖苷酶分子对接位点图。
15.图2：本发明中小分子肽pr对应的hplc液相图。
16.图3：本发明中小分子肽pr对应的lcms质谱图。
17.图4：本发明中小分子肽pr对hepg2细胞活力的影响。
18.图5：本发明中小分子肽pr对ir hepg2细胞葡萄糖消耗的影响。
具体实施方式
19.下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
20.采用不同的蛋白酶对蛋白质进行水解时，得到无数种寡肽、多肽等不通过氨基酸构建的肽链，其作用也不尽相同。
21.实施例1
22.水解后初步进行活性筛选：
23.在研究过程中采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶k作为复合水解酶，对杏仁蛋白进行水解，得到无水中不同结构的杏仁肽，通过杏仁肽的活性、毒性、水溶性及admet性质筛选后得到的杏仁小分子肽pggd(脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、pr(脯氨酸-精氨酸)、ppk(脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸)和gr(甘氨酸-精氨酸)四种杏仁小分子肽。
24.实施例2
25.分子对接：
26.通过将四种杏仁小分子肽与α-葡萄糖苷酶进行分子对接，明确上述小分子肽与α-葡萄糖苷酶的确切结合位点。
27.杏仁小分子肽与α-葡萄糖苷酶n端结构域的相互作用模式，具体如下：
28.(a)α-葡萄糖苷酶和pggd相互作用的三维和二维细节。
29.(b)α-葡萄糖苷酶和pr相互作用的三维和二维细节。
30.(c)α-葡萄糖苷酶和ppk相互作用的三维和二维细节。
31.(d)α-葡萄糖苷酶和gr相互作用的三维和二维细节。
32.进一步研究酶解得到的杏仁小分子肽与α-葡萄糖苷酶的对接位置和氢键作用。四种多肽都有9个结合位点。分子对接结果见图1，但是由于结合位点的的不同，使得各小分子肽与α-葡萄糖苷酶的结合性存在差异，最终选择结合能力较好的pr、ppk与pggd进行接下来的体外筛选及机理验证研究。
33.通过中国西安纳威生物技术有限公司合成了上述杏仁小分子肽pr、纯度为95％以上，如图2所示，其化学结构式为分子量为271.05，如图3所示。此外，也合成了同样具备与α-葡萄糖苷酶结合性优异的ppk和pggd，进行比较。
34.杏仁小分子肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性
35.采用磷酸缓冲液(ph 6.7,0.5m)120μl、样品液20μl(浓度变化梯度依次为2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml和12mg/ml)、α-葡萄糖苷酶(0.5μ/ml)50μl、底物4-硝基苯-β-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)50μl，置于96孔板中，37℃反应1h后，加入na2co3(0.67m)50μl停止反应，在405nm处测定溶液吸光度。收集了三次独立实验的数据。抑制活性计算公式如下:
[0036][0037]
式中，ai为用等量缓冲液替换样品的空白部分的吸光度；
[0038]
ab为样品的吸光度；
[0039]
ac为用等量缓冲液替换样品和pnpg溶液时对照品的吸光度。
[0040]
通过上述公式计算出ppk、pggd和ppk的ic
50
值分别为19.79
±
0.006μm和20.63
±
0.05μm和41.77
±
0.07μm。
[0041]
实施例3
[0042]
杏仁小分子肽对hepg2细胞活力的影响：
[0043]
200μmol/l pggd和pr处理hepg2细胞后，细胞活力显著降低(p《0.05)。与正常hepg2细胞相比，12.5-100μmol/l浓度的pggd和pr对hepg2细胞无明显毒性(p》0.05)，说明低于200μmol/l浓度的pggd和pr对hepg2细胞无毒性。pggd和pr(12.5-100mol/l)处理ir hepg2细胞后，结果如图4所示，表明pggd和pr(12.5-100mol/l)可用于ir hepg2细胞，且无细胞毒性。
[0044]
实施例4
[0045]
诱导胰岛素抵抗(ir)模型及血糖消耗测定：
[0046]
按照之前的研究(ding et al.，2021)诱导ir细胞培养模型。hepg2细胞接种于96孔板1
×
105cells/well(100μl/well)，培养24h后，在无血清培养基中饥饿处理12h。pbs洗涤3次，然后用含25mmol/l葡萄糖和10mol/l胰岛素的dmem,37℃，5％co2气氛下处理24h，诱导ir。随后将pr和pggd分别在培养基中稀释至不同浓度，与ir hepg2细胞共同孵育。没有胰岛素处理的细胞作为空白对照，磷酸盐缓冲液(而不是样品)作为模型对照。葡萄糖测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)测定上清液中的葡萄糖浓度。测试结果如图5所
示，在pr为100μmol/l浓度下，对ir hepg2细胞葡萄糖消耗最高，达到11.7mmol/l，抑制率达到46.8％。
[0047]
杏仁小分子肽对ir hepg2细胞irs-1/pi3k/akt和ampk信号通路表达的影响
[0048]
pr可激活高糖诱导的ir hepg2细胞的irs-1/pi3k/akt和ampk信号通路。在ir hepg2细胞中，100μmol/l的pr肽通过促进glut4的表达和转运而增加葡萄糖的摄取和转运。通过调价糖原合成直接相关的p-gsk3β(ser9)、gsk3β和gs的蛋白表达，影响糖原合成。
[0049]
实施例5
[0050]
将本发明中合成的杏仁小分子肽pr制备成纳米材料：
[0051]
首先将牛血清白蛋白和海藻酸钠按照质量比为4:1溶于磷酸盐缓冲液中配制成1％(w/w)的溶液，4℃放置过夜，磁力搅拌5h使溶液混合均匀，然后进行冻干制备成粉末。将冻干的粉末置于烘箱中，在70℃条件下进行美拉德反应，反应48h生成共价化合物，将共价化合物溶解于水中配制成一定浓度为4mg/ml的溶液，调节ph至5.5，即形成纳米颗粒，将纳米颗粒在90℃条件下加热30min制得纳米凝胶，按照纳米凝胶与杏仁小分子肽质量比为6:1混合。冰浴条件下进行超声处理(超声功率为200w，没间隔10s超声10s，整体时间为6min)，超声处理后将其ph调节至4，静置10min后，得到的混合物置于10kda超滤离心管中，3500r/min离心10min，取滤过液100μl稀释10倍，制得待测样品。
[0052]
采用紫外分光光度计测定包埋率。本实验室通过紫外扫描得杏仁肽在214nm处的吸光度最大，因此在214nm处进行测定吸光度，计算得到游离杏仁肽浓度，得出包埋率为73.06％，此时制备的纳米材料的粒径平均值为187.7nm。
[0053]
将未进行包埋的杏仁小分子肽pr和经包埋处理后的小分子肽纳米材料，过模拟体外胃肠道消化：
[0054]
第一步：模拟胃消化道
[0055]
用1mol/l的盐酸将杏仁肽纳米粒溶液调ph值至2.0，水浴加热至37℃后，加入胃蛋白酶(加量为杏仁肽含量的5％)，适当搅拌，恒温酶解2h。在此过程中，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0h取样，立即放入沸水浴中灭酶10min，冷却后，测定样品经胃消化酶消化后的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
[0056]
第二步：模拟肠消化道
[0057]
样品经过胃消化道酶系消化2h后，用5mol/l的naoh溶液调节体系的ph值至7.0。继续加热至37℃，加入胰蛋白酶(加量为多肽含量的5％)，适当搅拌，恒温酶解2h。在此过程中，分别于3.0、4.0、5.0、6.0h取样，立即置于沸水浴中灭酶10min，冷却后，测定样品经胃消化酶消化后的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
[0058]
通过模拟体外胃肠道消化后，发现α-葡萄糖苷酶抑制活性变化如表1所示。
[0059]
表1：α-葡萄糖苷酶抑制活性变化
[0060]
α-葡萄糖苷酶抑制率0h0.5h1h1.5h2h2.5h3h3.5h小分子肽pr(％)60.370.980.376.980.265.146.947.4pr纳米材料49.656.877.875.479.564.261.561.8 4h4.5h5h5.5h6h6.5h7h7.5h小分子肽pr48.346.342.343.244.141.238.437.6pr纳米材料62.463.263.763.964.164.364.564.4
[0061]
通过与以上相同的方法对pggd进行包埋，发现包埋率较低，仅仅为54.7％。经过模拟体外胃肠道消化，7h后，包埋后的pggd纳米材料对α-葡萄糖苷酶抑制率维持在39.7％，未经过包埋的pggd对α-葡萄糖苷酶抑制率为29.4％。