利用维奈托克增强T细胞的方法

利用维奈托克增强t细胞的方法
1.相关申请
2.本技术要求于2020年2月7日提交的美国临时申请号62/971,534的的优先权，其全部内容通过引用并入本技术。
技术领域
3.本公开涉及用于治疗癌症的免疫疗法，更具体地，涉及使用维奈托克(venetoclax)增强t细胞以治疗癌症。


背景技术：

4.过继性细胞疗法(act)显著改善了某些癌症类型(如b细胞白血病和黑色素瘤(1、2))患者的预后。虽然这些成功案例证明了act的效力，但在其它的癌症类型上尚未获得类似的临床成效。举例而言，急性髓性白血病(aml)在患者内部和患者之间均表现为高度异质性的疾病，尽管人们正在研究各种act方法以试图改善罹患这种高致死性疾病患者的预后，但针对aml的act尚未取得临床上的成功(3)。因此，仍然需要用于治疗癌症的改进的act疗法。
5.一种形式的act是使用特殊的t细胞亚群，其被定义为cd4-和cd8-双阴性t(dnt)细胞。在临床前模型中，不同于许多其他t细胞疗法，从健康志愿者体扩增的同种异体dnt细胞的输注不会对正常细胞引起同种异体反应性，并且对受体的免疫排斥产生抗性，这支持其被用作“现货”act的潜力(3-6)。然而，dnt细胞的抗癌作用并不完全(5、6)，因此，能够进一步增强dnt细胞抗肿瘤活性的方法可让患者收获更好的预后。
6.发明概述
7.一方面，已确定维奈托克通过增加t细胞介导的细胞毒性来增强t细胞治疗效果。
8.用被批准用于各种临床用途的269种药物的库中的化合物对t细胞进行预处理，随后，将经化合物处理的细胞用作针对人aml细胞系的效应物。令人惊讶的是，bcl-2抑制剂维奈托克最大程度地增加了t细胞的细胞毒性。(图1)。
9.如实施例中所述，经维奈托克预处理的t细胞在体外对aml表现出增强的t细胞介导的细胞毒性。此外，经维奈托克处理的t细胞在异种移植模型中表现出增加的抗肿瘤活性。维奈托克增强了t细胞的细胞毒性，而其他bcl-2家族蛋白抑制剂却不能。与未经处理的t细胞相比，经维奈托克处理的t细胞具有t细胞活化标志物cd25和cd69的更高表达，以及效应分子nkg2d和dnam-1的更高表达。与未经处理的细胞相比，经维奈托克处理的t细胞还表现出增加水平的活性氧类(ros)。还证明治疗相关浓度的维奈托克增加t细胞效应功能，而不会降低t细胞活力。此外，从接受维奈托克的患者体内分离出的t细胞显示ros水平增加。
10.因此，在一个实施方案中，提供了一种增强t细胞疗效的方法，所述方法包括使t细胞与维奈托克接触以生成功能增强型t细胞。
11.如本文所述使用维奈托克对t细胞进行预处理生成增强型t细胞，所述增强型t细胞具有使所述细胞更有效地治疗癌症的若干特征。例如，在一个实施方案中，使用维奈托克
增加t细胞介导的细胞毒性。在一个实施方案中，使用维奈托克增加t细胞介导的抗肿瘤活性。在一个实施方案中，使所述t细胞与维奈托克接触增加效应记忆状态的t细胞的相对比例。
12.在一个实施方案中，所述t细胞为常规t细胞(cd4

或cd8

)。在一个实施方案中，所述t细胞为非常规t细胞，例如双阴性t细胞(cd4-、cd8-)。
13.在一个实施方案中，所述方法包括使所述t细胞与浓度为至少50nm的维奈托克接触。在一个实施方案中，所述方法包括使所述t细胞与浓度为至少100nm、至少200nm、至少300nm或至少400nm的维奈托克接触，可选地，所述方法包括使所述t细胞与浓度为约100nm至1约μm的维奈托克接触。
14.在一个实施方案中，所述方法包括使所述t细胞与维奈托克接触至少约30分钟、至少约45分钟或至少约60分钟。在一个实施方案中，所述方法包括使所述t细胞与维奈托克接触至少1小时、至少1.5小时、至少2小时或至少4小时。在一个实施方案中，所述方法包括使所述t细胞与维奈托克接触至少6小时、至少8小时或至少12小时，可选地，约1小时至约7日。在一个实施方案中，所述方法包括使所述t细胞与维奈托克接触至少1小时且少于约14日、10日、9日、8日、7日、6日或5日。在一个实施方案中，所述方法包括使所述t细胞与维奈托克接触一段时间，相对于未接触维奈托克的对照细胞，所述时间足以增加t细胞对cd25、cd69、nkg2d、dnam-1和nrf2中一种或更多种的表达水平。在一个实施方案中，所述方法包括使所述t细胞与维奈托克接触一段时间，相对于未接触维奈托克的对照细胞，所述时间足以增加细胞活性氧类(ros)的水平。在一个实施方案中，所述t细胞是体外的。在另一个实施方案中，所述t细胞是体内或离体的。
15.本文所述的增强型t细胞易于与未经维奈托克预处理的t细胞区分。在一个实施方案中，使所述t细胞与维奈托克接触增加cd25、cd69、nkg2d、dnam-1和nrf2中的一种或更多种的表达水平。在一个实施方案中，使所述t细胞与维奈托克接触增加细胞活性氧类(ros)的水平。
16.本文还提供了采用本文所述方法生成的增强型t细胞群。在一个实施方案中，与未接触维奈托克的对照t细胞相比，所述增强型t细胞呈现出cd25、cd69、nkg2d、dnam-1和nrf2中的一种或更多种的增加的表达水平。在一个实施方案中，与未接触维奈托克的对照t细胞相比，所述增强型t细胞呈现出增加水平的细胞活性氧类(ros)。
17.在一个实施方案中，与未接触维奈托克的对照t细胞群中效应记忆状态的t细胞与幼稚状态的t细胞的比例相比，所述增强型t细胞群中效应记忆状态的t细胞与幼稚状态的t细胞的比例增加。
18.在一个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含t细胞和维奈托克。还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述用维奈托克处理的增强型t细胞。
19.还提供了如本文所述的增强型t细胞、组合物和/或t细胞与维奈托克的组合用于治疗有此需要的受试者的癌症的用途。在一个实施方案中，提供了一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的增强型t细胞、组合物和/或t细胞与维奈托克的组合。在一个实施方案中，所述癌症是白血病，可选地，是急性髓性白血病(aml)。
20.根据以下详细描述，本公开的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，
在示出本公开的优选实施方案的同时，详细描述和具体实施例仅用于示例说明，因为在本公开的精神和范围内做出的各种改变和修改通过该详细描述对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
21.现在将结合附图描述本公开的一个或更多个实施方案，在附图中：
22.图1.药物筛选试验确定维奈托克是增强t细胞抗aml的细胞毒性的首选药物。药物筛选试验示意图，进行该试验以鉴定可与dnt细胞联合使用以产生协同抗肿瘤活性的临床批准药物。用269种不同的临床批准药物以400nm处理dnt细胞过夜。随后，洗涤经化合物处理的细胞，然后与aml细胞一起培养两小时。点状图示出了相对于未经处理的dnt细胞，dnt细胞介导的针对aml细胞的细胞毒性程度的变化。
23.图2.维奈托克在体外增强t细胞介导的针对aml的细胞毒性。(a)为了确认药物筛选的结果，使用未经处理的dnt细胞或经不同浓度的ven(50nm、100nm、200nm、400nm)预处理过夜的dnt细胞针对aml细胞系oci-aml2、oci-aml3和kg1a进行体外杀伤试验。数据代表四个生物学重复。(b)使用经400nm ven预处理的dnt细胞作为效应物针对原发性aml患者样本(n＝17)进行体外细胞毒性试验。(c)为了测定经ven处理或未经ven处理的dnt细胞针对白血病起始细胞的活性，在基于甲基纤维素的集落形成试验中，以每毫升103个细胞接种未经处理的aml或用未经处理的dnt细胞或经ven处理的dnt细胞处理的aml，并于10日后测定形成的集落数。该实验使用oci-aml2和kg1a以及患者样本140372、100857、110162和141065进行。(d)从dnt细胞移除药物后，经维奈托克处理后所增加的、针对三种aml细胞系oci-aml2、oci-aml3和kg1a的效应活性保持至少4日。该实验使用来自两个不同供体(upn119和upn38)的dnt细胞进行。(e)aml对dnt细胞的敏感性与经ven处理后dnt细胞介导的细胞毒性增加程度之间的相关性。(f)从11个供体扩增的dnt未经处理或用400nm维奈托克处理18小时。随后，将其与oci-aml2以1:1、2:1或4:1的dnt:aml比例进行培养，并通过膜联蛋白v染色和流式细胞术测定aml细胞的活力。每一配对符号表示来自单个供体的dnt。
24.图3.在异种移植模型中，用ven预处理dnt细胞增加其抗肿瘤活性。为了确定经ven预处理的dnt细胞是否在异种移植模型中诱导更高的抗白血病活性，在肿瘤大小达到100mm3(箭头所示)时，皮下移植2x106oci-aml2细胞的nod/scid小鼠通过静脉输注pbs(
●
)、2x107未经处理的dnt细胞(
■
)或2x107经ven处理的dnt细胞(
▲
)。监测肿瘤体积直到pbs处理组达到人道终点(a)，并且在白血病接种后第20日测量肿瘤重量(b)。所示结果代表了使用来自三个不同供体的dnt细胞进行的三个独立实验。(c)用pbs、dnt细胞或vendnt细胞处理全身输注kg1a的nsg小鼠。比较各组间kg1a的骨髓移植情况。与pbs和dnt细胞处理组相比，经vendnt处理的小鼠显示明显更低的kg1a移植水平，进一步支持了vendnt细胞即使针对以另外方式具有抗性的那些亦能表现出优异的抗白血病活性。(d)将原发性aml细胞(id:130607)，其未经处理或用dnt或经ven处理的dnt以2:1的dnt:aml比例处理2小时，经股骨内注入nod/scid小鼠中(每只小鼠1.6x106个细胞；n＝每组6只)。注射后6周，通过流式细胞术测定每组的骨髓中aml移植(人cd45

cd33

细胞)的百分比。(e)向接受亚致死辐射的nsg小鼠静脉注射原发性aml细胞(n＝4；2
–
5x106/小鼠)。两周后，通过三次输注(媒介物对照或每次输注1.5
–
2x107个dnt细胞或经ven处理的dnt细胞)处理小鼠，每次间隔3-4日。aml注射后5
周，通过流式细胞术测定原发性aml细胞(人cd45
低
cd33

，表达或不表达cd34)的骨髓移植情况。(左)用cd45和cd33染色的各组的bm细胞的代表性等高线图。(右)使用四种不同的原发性aml患者样本进行的患者来源的异种移植实验的汇总结果。横杠表示归一化到媒介物对照组的bm aml移植水平的平均值，每个符号表示单独的小鼠，误差条表示sd。数据表示相对于pbs组，骨髓白血病水平的平均值
±
sem下降。采用学生t检验或单因素方差分析(one-way anova)进行统计。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。
25.图4(a).维奈托克增强cd4

或cd8

常规t细胞的抗白血病活性。未经处理或经不同浓度ven(25nm、50nm、100nm、200nm或400nm)处理的离体扩增的t
conv
细胞用作针对aml细胞系(oci-aml2、oci-aml3和kg1a)的效应细胞。所示结果代表四个生物学重复。图4(b).维奈托克快速、直接增加t细胞针对aml的细胞毒性。未经处理或用维奈托克(100nm和400nm)分别处理4h、18h和3日的dnt(上图)和t
conv
细胞(下图)。随后，测定其对oci-aml2的细胞毒性。数据表示来自四个不同供体t细胞的结果的平均值
±
sem。图4(c).未经处理或用维奈托克(100nm或400nm)处理4小时的dnt和t
conv
细胞。随后，测定其活力。数据表示来自四个不同供体t细胞的结果的平均值
±
sem。
26.图5.维奈托克增强dnt细胞的抗白血病活性，而奥巴克拉(obatoclax)和abt-737则不能。(a)dnt细胞分别用不同浓度的奥巴克拉、abt-737或维奈托克预处理过夜，然后，用作针对oci-aml2的效应细胞。(b)结果示出了与未经处理的dnt诱导的杀伤程度相比，dnt介导的细胞毒性的变化率。(c)通过蛋白印迹测定bcl-xl和bcl-2在由三个供体(upn38、upn108和upn134)离体扩增的dnt细胞以及aml细胞系oci-aml2、tex、nb4和k562上的表达。采用微管蛋白作为上样对照。
27.图6.ven增加dnt细胞上活化标志物和效应分子的表达。离体扩增的dnt细胞未经处理或用400nm ven处理，并针对t细胞(a)活化标志物cd25和cd69以及(b)效应分子(nkg2d和dnam-1)的表达进行染色。每对点代表ven处理前后来自同一供体的dnt细胞。该实验使用来自四个(a)或六个(b)不同供体的dnt细胞进行。(c)用不同浓度的ven处理的dnt细胞中颗粒酶b的表达。所示结果代表两个生物学重复。(d)在经ven处理的cd8 t细胞上也观察到cd25、nkg2d和dnam-1表达的剂量依赖性增加。
28.图7.ven增加dnt细胞中的细胞ros水平并增强其细胞毒活性。(a)通过cellrox
tm
染色检测的、经不同浓度ven处理的dnt细胞(左)或cd8

t细胞(右)的细胞ros水平。(b)(左)经qpcr测定的、由细胞ros水平调节的转录因子nrf2的相对表达。(右)经400nm ven处理或未经400nm ven处理的dnt的细胞质和细胞核部分的nrf2蛋白质免疫印迹试验，旨在确定nrf2蛋白的位置。使用来自三个不同供体(upn38、upn108和upn134)的dnt生成数据。(c)为了确定经ven处理的dnt中ros水平增加的功能相关性，在不同浓度的ros清除剂n-乙酰半胱氨酸(nac)的存在下，经400nm ven处理的dnt中的ros水平，并在体外杀伤试验中将这些细胞用作针对aml的效应细胞。所示结果代表了三个独立实验。(d)为了确定经ven处理的dnt中ros的产生来源，对未经处理的dnt或经400nm处理的dnt进行非变性凝胶和免疫印迹试验，以检测电子传递链超级复合物亚基的组分(ndufa9、uqcrc2和mtco1)。所示结果代表了使用来源于两个不同供体的dnt进行的三个独立实验。(e和f)对于dnt细胞(e)和cd8

t
conv
细胞(f)，ven增加了效应记忆阶段的细胞比例，同时降低了中央型记忆t细胞的频率。(g)ven对dnt细胞的糖酵解、糖酵解能力和基础耗氧率无显著影响。(h-k)dnt(h和i)或t
conv
细胞(j和k)分
别用0nm、100nm或400nm的维奈托克处理4小时、18小时和2日。细胞用cellrox(h和j)或mitosox(i和k)染色。通过流式细胞术测量细胞或线粒体(mt)ros的mfi。数据表示来自四个不同供体t细胞的结果的平均值
±
sem。(l)用含或不含2mm nac的400nm维奈托克处理dnt 18小时。流式直方图示出了经流式细胞术测量的细胞ros水平。经流式细胞术测量cd25和cd69的mfi。实验重复三次进行，所示数据代表使用来自两个供体的dnt进行的两个独立实验。(m)用400nm维奈托克处理dnt细胞18小时。处理后，分离线粒体，通过sds-page凝胶法和使用抗ndufb8(复合物i)、sdha(复合物ii)、uqcrc2(复合物iii)、mtco1(复合物iv)的抗体的免疫印迹法测量呼吸链复合物亚基的水平。
29.图8.在接受ven aza处理的患者中，与细胞毒活性相关的t细胞亚群的比例有所增加。分别于ven aza处理前及处理的第4日采集患者外周血样本，并采用流式细胞术测定不同t细胞亚群的频率、效应分子表达及细胞ros的水平。(a)比较ven aza处理前后获得的样本之间的cd8

和dnt细胞的频率。(b-e)比较cd8

t(b和c)和dnt(d和e)细胞群中效应记忆t细胞亚群(cd45ra-cd62l-)的频率、nkg2d的表达水平及细胞ros水平。所示图表是来自四位患者的样本结果的汇总。
30.图9.可以看出，经ven处理和未经其处理的dnt细胞对自体和同种异体pbmc的杀伤程度不显著。
31.图10.维奈托克在增强其针对aml的细胞毒性的同时，不会杀伤dnt。(a)通过膜联蛋白v染色法和流式细胞术测定经400nm维奈托克处理18小时的dnt和oci-aml2细胞的活力。(b和c)用浓度递增的维奈托克处理dnt 18小时。随后，测定其对oci-aml2和两种原发性aml细胞(090765和110162)的活力(b)和细胞毒性(c)。采用anova进行统计。****p《0.0001。
32.图11.对于诊断性和复发性/难治性aml样本，维奈托克对dnt介导的细胞毒性具有类似的作用。将经400nm维奈托克处理或未经处理的dnt与诊断性(n＝12)或复发性/难治性(n＝4)原发性aml样本以2:1的比例共培养2小时。确定了对于每种患者样本类型，经维奈托克处理后，dnt介导的细胞毒性的增加。
33.图12.在存在维奈托克的情况下，dnt诱导优异的抗白血病活性。(a)在dnt存在或不存在的情况下，kg1a和oci-aml2细胞未经处理或使用维奈托克(100nm)处理。(b)在存在或不存在维奈托克(100nm)的情况下，经dnt导致的aml计数减少的百分比。
34.图13.经ven处理的dnt在不增加骨髓中t细胞移植的情况下诱导aml总数更大地降低。向接受亚致死辐射(250cgy)的nsg小鼠静脉注射kg1a细胞(2x106个细胞/小鼠)或原发性aml细胞。两周后，通过三次输注(媒介物对照(pbs)或每次输注1.5-2x107个dnt细胞或经ven处理的dnt细胞)处理小鼠，每次间隔3-4日。注射aml后五周，通过用抗人cd45、cd3、cd33和cd34抗体对骨髓细胞进行染色和流式细胞术分析，测定骨髓中的aml细胞计数(a)和t细胞频率(b)。
35.图14.未经处理的dnt和经维奈托克处理的dnt不引起组织损伤。向接受亚致死辐射(250cgy)的nsg小鼠静脉注射kg1a细胞(2x106个细胞/小鼠)。两周后，通过三次输注(媒介物对照(pbs)或每次输注1.5-2x107个dnt细胞或经ven处理的dnt细胞)处理小鼠，每次间隔3-4日。第35日，肝脏(顶部)和肺(底部)组织用苏木精和伊红(h&e)染色(放大50倍)。pv-门静脉；alv-肺泡；br-细支气管。
36.图15.其他已知的ros诱导试剂对dnt活力、ros水平和抗aml的细胞毒性的影响。用
中均有所描述，所有这些文献的全部内容通过引用并入本文。
47.本文使用的术语“增强型t细胞”是指与未接触过维奈托克的对照t细胞相比，在接触维奈托克后表现出增加的细胞毒性和/或抗肿瘤活性的单个t细胞或t细胞群。可选地，增强型t细胞可以是dnt或常规t细胞(t
conv
)。在一个实施方案中，可根据生理活性和/或基因表达区分增强型t细胞与其他t细胞和/或对照t细胞。例如，在一个实施方案中，与未接触维奈托克的对照t细胞相比，增强型t细胞中，cd25、cd69、nkg2d、dnam-1和nrf2中一种或更多种的表达水平呈现出增加。在一个实施方案中，与未接触维奈托克的对照t细胞相比，增强型t细胞中，选自cd25、cd69、nkg2d、dnam-1和nrf2的2、3、4或5种基因的表达水平呈现出增加。
48.本文使用的术语“接触(contacted或contacting)”是指任何将t细胞暴露于维奈托克以生成增强型t细胞的方法。“接触”包括“孵育”和“暴露”,其并未暗示有任何具体时间或温度要求，除非另有说明。在一个实施方案中，t细胞在体外与维奈托克接触，例如将维奈托克与培养基组合并于培养基中暴露或孵育t细胞。t细胞可以通过体外孵育与维奈托克“接触”，也可以通过向受试者给药或联合给药使t细胞在体内与维奈托克“接触”。
49.在一个实施方案中，t细胞在体外、离体或体内与浓度为至少25nm、50nm或100nm的维奈托克接触。在一个实施方案中，t细胞与浓度为至少100nm、至少200nm、至少300nm或至少400nm的维奈托克接触。在一个实施方案中，t细胞与浓度为约10nm至10μm，可选地为约50nm至500nm、约50nm至800nm或约100nm至约1μm的维奈托克接触。
50.在另一个实施方案中，t细胞与维奈托克接触至少约30分钟、45分钟、60分钟或90分钟。在一个实施方案中，t细胞与维奈托克接触至少约1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或48小时。在一个实施方案中，t细胞与维奈托克接触约1小时至14日，可选地2小时至30日、约4小时至14日、约4小时至6日、约4小时至48小时或约6小时至约24小时。在一个实施方案中，t细胞与维奈托克接触少于约14日、10日、9日、8日、7日、6日或5日。
51.在一个实施方案中，t细胞与足够浓度的维奈托克接触足够的时间，以增加cd25、cd69、nkg2d、dnam-1和nrf2中一种或更多种的表达。在一个实施方案中，t细胞与足够浓度的维奈托克接触足够的时间，以增加细胞ros水平。
52.在一些实施方案中，t细胞与维奈托克接触以成为增强型t细胞，可移除部分或全部维奈托克，或分离增强型t细胞以降低浓度或减少细胞外维奈托克。
53.如本文所述，使t细胞与维奈托克接触生成增强型t细胞群，该增强型t细胞群具有使它们特别适用于治疗癌症的若干特征。例如，在一个实施方案中，维奈托克增加t细胞介导的抗肿瘤活性。在一个实施方案中，维奈托克增加t细胞介导的细胞毒性。
54.本文使用的术语“抗肿瘤活性”是指杀伤肿瘤细胞和/或抑制肿瘤生长的任何活性。在一个实施方案中，“抗肿瘤活性”包括减少肿瘤细胞的集落形成。
55.本文使用的术语“细胞毒性”是指引起细胞死亡、导致细胞成为细胞抑制性的和/或阻止细胞增殖的特质。
56.ii.产品、组合物和试剂盒
57.另一方面，提供了根据本文所述的方法生成的增强型t细胞群。还提供了包含如本文所述的增强型t细胞的组合物。例如，在一个实施方案中，增强型t细胞，可选地与药学上
可接受的载体一起，包含在药物组合物中。
58.在另一个实施方案中，提供了一种组合物，该组合物包含t细胞和维奈托克。在一个实施方案中，所述组合物还包含细胞培养基。
59.还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含t细胞和维奈托克。在一个实施方案中，试剂盒还包括用于执行本文所述方法的使用说明，例如用于生成增强型t细胞、用于治疗癌症或用于减缓肿瘤生长或增殖的使用说明。在一个实施方案中，t细胞和维奈托克在不同的容器中。在一个实施方案中，t细胞和维奈托克在同一容器中，可选地作为含有药学上可接受的载体的组合物。
60.还提供了本文所述的产品、组合物或试剂盒用于治疗癌症或制备用于治疗癌症的药物的用途。
61.iii.治疗癌症和减缓肿瘤生长和增殖的方法与用途
62.与未经维奈托克处理的t细胞相比，通过本文所述方法生成的增强型t细胞在体外增加了针对aml细胞的细胞毒性。如实施例2所示，与用对照t细胞处理的aml细胞相比，经增强型t细胞处理的aml细胞表现出对aml细胞的更加特异性的杀伤和更少的集落形成。此外，实施例3证明增强型t细胞在肿瘤异种移植模型中具有更强的抗肿瘤活性。
63.因此，在一个实施方案中，提供了一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的增强型t细胞。在一个实施方案中，如本文所述，通过使t细胞与维奈托克接触来生成增强型t细胞。在一个实施方案中，方法包括向受试者施用t细胞和维奈托克，该t细胞和维奈托克可选地与药学上可接受的载体组合成组合物，其中t细胞通过在体内与维奈托克接触而增强。
64.还提供了一种减缓肿瘤生长和/或增殖的方法。在一个实施方案中，方法包括使肿瘤与有效量的增强型t细胞接触。在一个实施方案中，如本文所述，通过使t细胞与维奈托克接触来生成增强型t细胞。
65.还提供了如本文所述的增强型t细胞、组合物和/或试剂盒用于治疗有此需要的受试者的癌症的用途。在一个实施方案中，根据本文所述的方法生成增强型t细胞。在一个实施方案中，增强型t细胞、组合物和/或试剂盒用于制造用于治疗癌症的药物。在一个实施方案中，用途包括向受试者使用或施用增强型t细胞。在另一个实施方案中，该用途包括在同一时间或不同时间向受试者使用或施用维奈托克和t细胞。
66.还提供了减缓肿瘤生长和增殖的用途。在一个实施方案中，本文所述的增强型t细胞、组合物和/或试剂盒用于减缓肿瘤生长和增殖。在一个实施方案中，增强型t细胞、组合物和/或试剂盒用于制造减缓肿瘤生长和增殖的药物。在一个实施方案中，增强型t细胞和/或组合物用于制造减缓肿瘤生长和增殖的药物。在一个实施方案中，t细胞和维奈托克用于制造减缓肿瘤生长和增殖的药物。
67.本文使用的术语“癌症”是指由不受控制的异常生长的细胞(其可扩散至邻近组织或身体其他部位)导致的一系列疾病中的一种。在一个实施方案中，癌症是白血病，例如急性髓性白血病(aml)。
68.术语“癌细胞”是指以不受控制的异常生长和侵袭另一组织能力为特征的细胞或来源于这种细胞的细胞。例如，癌细胞包括从癌症患者获得的原发性癌细胞或来源于这种细胞的细胞系。在一个实施方案中，癌细胞是白血病细胞，例如aml细胞。
69.本文使用的术语“白血病”是指涉及在造血组织、其他器官，通常情况下在血液中发现的异常白细胞数量增加的进行性增生的任何疾病。“白血病细胞”是指特征在于细胞增加的异常增生的白细胞。白血病细胞可以从诊断为罹患白血病的受试者获得。
70.术语“急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)”或“急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia)”(“aml”)是指髓性血细胞癌症，其以快速生长的异常白细胞在骨髓里聚集并干扰正常血细胞的生成为特征。骨髓增生异常综合征或骨髓增生综合征等白血病前期病况也可能发展为aml。
71.术语“肿瘤”是指癌细胞的集合。在一个实施方案中，肿瘤是白血病肿瘤，例如aml细胞。在一个实施方案中，肿瘤是血液肿瘤。
72.本文使用的术语“受试者”包括动物界的所有成员，包括哺乳动物，适当情况下其指人类。可选地，术语“受试者”包括已诊断出罹患癌症或处于缓解期的哺乳动物。在一个实施方案中，受试者已经接受治疗或同时正在接受化疗(可选地使用阿糖胞苷和/或氮杂胞苷)。
73.在一个实施方案中，本文所述的方法和用途涉及施用或使用有效量的增强型t细胞，或有效量的t细胞和维奈托克。
74.本文使用的短语“有效量”或“治疗有效量”是指对于实现预期效果所需的剂量和时间段有效的量。例如，在治疗癌症的情况下，与未经治疗产生的反应相比，有效量是例如诱导缓解、减少肿瘤负荷和/或防止肿瘤扩散或癌细胞生长的量。在一个实施方案中，维奈托克的有效量是指增加t细胞介导的抗肿瘤活性和/或增加t细胞介导的细胞毒性的量。在一个实施方案中，增强型t细胞的有效量是指在体外或体内具有足以抗癌症和/或肿瘤细胞的细胞毒性的量。
75.有效量会因动物的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而异。与这样的量相对应的给定剂量的量会因各种因素而异，例如药物制剂、给药途径、疾病或疾患的类型、接受治疗的受试者或宿主的身份等，但通常仍可由本领域技术人员确定。在一个实施方案中，以注射方式向受试者施用增强型t细胞或t细胞和维奈托克。在一个实施方案中，注射为静脉注射。在一个实施方案中，注射为皮下注射，可选地在肿瘤部位。
76.在一个实施方案中，增强型t细胞或t细胞与维奈托克的组合可用于在体外、离体或体内减缓癌细胞的生长或增殖。本文使用的“减缓癌细胞的生长或增殖”是指减少由于细胞生长或细胞分裂而导致的来源于癌细胞的细胞的数量，其包括细胞死亡。本文使用的术语“细胞死亡”包括杀伤细胞的所有形式，包括细胞裂解、坏死和/或凋亡。在一个实施方案中，增强型t细胞或t细胞与维奈托克的组合可用于在体外、离体或体内杀伤癌细胞。
77.在一个实施方案中，可以使用本领域已知的药学上可接受的配方来配制增强型t细胞或t细胞和/或维奈托克，以供受试者使用，或制备后施用于受试者。例如，在《雷明顿制药学》(2003年第20版)和1999年出版的《美国药典：国家处方集》(usp 24nf19)中描述了用于选择和制备合适制剂的常规规程和成分。术语“药学上可接受的”是指与动物，特别是人类的治疗相容。
78.在一个实施方案中，同时向受试者施用t细胞和维奈托克，可选地，其作为包含t细胞和维奈托克的组合物，或作为两个单独的剂量施用。在一个实施方案中，在不同时间对受试者使用或施用t细胞和维奈托克。例如，在一个实施方案中，在施用维奈托克之前或之后
使用或施用t细胞。在一个实施方案中，在施用维奈托克之前或之后使用或施用t细胞，使用或施用的间隔时间小于约1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、8小时、10小时、12小时、16小时或24小时。在一个实施方案中，在施用维奈托克之前或之后使用或施用t细胞，使用或施用的间隔时间小于约1日、2日、3日、4日、5日、6日或7日。
79.在一个实施方案中，使用或施用维奈托克，以使其在受试者体内的浓度达到至少25nm、50nm或100nm。在一个实施方案中，使用或施用维奈托克，以使其在受试者体内的浓度达到至少100nm、至少200nm、至少300nm或至少400nm。在一个实施方案中，在施用或使用外源性t细胞，可选地在施用或使用dnt的同时，确立了维奈托克的浓度为至少25nm、50nm、200nm、300nm或400nm。
80.在一个实施方案中，维奈托克每日使用或施用的剂量为50mg至800mg，可选地为100mg至600mg。例如，在一个实施方案中，与t细胞联合使用或施用，将维奈托克对受试者使用或施用，进而通过维奈托克增强在体内t细胞。
81.以下非限制性实施例用于说明本公开。
82.实施例1：维奈托克增加t细胞介导的细胞毒性的效力
83.为了鉴定增加t细胞介导的抗aml的细胞毒性效力的分子，使用体外扩增的dnt细胞作为抗白血病t细胞的替代物，并用批准用于各种临床用途的269种药物的化合物库进行预处理。随后，将经化合物处理的细胞用作抗人aml细胞系oci-aml2的效应物。bcl-2抑制剂(ven)最大程度地增加了dnt细胞的细胞毒性(图1)。
84.ven主要用于治疗慢性淋巴细胞白血病(cll)和小淋巴细胞白血病，其中ven抑制抗细胞凋亡分子bcl-2的活性，促进恶性肿瘤细胞的凋亡。对于复发性/难治性cll患者，ven作为单一疗法的总应答率为64.8
–
79.4％(9)。最近，ven已被fda批准与去甲基化药物氮杂胞苷或地西他滨一起用于aml患者的治疗，因为这些药物显著改善了不适合其他常规治疗的未接受治疗的aml患者的预后(18、20)，尽管其潜在机制尚不清楚。此外，之前未报道过ven具有免疫刺激活性。
85.实施例2：ven预处理以剂量依赖性方式增加dnt细胞对三种不同aml细胞系的细胞毒性
86.为了确认药物筛选的结果，用不同浓度的ven预处理dnt细胞。用ven预处理以剂量依赖性方式增加了dnt细胞对三种不同aml细胞系aml2-oci、aml3-oci和kg1a的细胞毒性(图2a)。与未经处理的dnt相比，经ven处理的dnt对17个原发性aml样本中的16个样本也显示出较高的细胞毒性(图2b)。值得注意的是，经ven处理的dnt有效地杀伤了四个对dnt具有抗性的样本(090271、080043、290985和150099)。经ven处理的dnt在杀伤确诊阶段以及诱导化疗后复发性/难治性患者的aml细胞方面同样有效(图11)。此外，经维奈托克处理的dnt细胞还更有效地减少了aml细胞系aml2-oci和kg1a以及原发性aml胚细胞(blast)的集落形成，证明了其对白血病起始细胞的作用(图2c)(9
–
12)。
87.如图2a所示，用不同浓度的ven预处理的dnt细胞对三种aml细胞系oci-aml2、oci-aml3和kg1a的细胞毒性呈剂量依赖性增加。从dnt细胞中移除药物后，经维奈托克处理增加的这种效应活性至少保持了4日(图2d)。观察到aml对dnt细胞的敏感性与经ven处理后的dnt细胞介导的细胞毒性增加程度之间呈现明显的负相关(图2e)。维奈托克增加了dnt介导
的对aml细胞的杀伤作用(图2a)，但没有降低dnt的活力(图10)。由图可知，经维奈托克处理的dnt(经ven处理的dnt)的抗白血病活性在来自所有十一个测试dnt供体的dnt中均有增加，平均增加了61.25
±
31％(图2f)。
88.为了测定维奈托克存在时dnt的抗白血病活性，用维奈托克、dnt或两者处理kg1a和oci-aml2。用dnt和维奈托克两者处理aml细胞比单独使用任一种处理产生的活aml细胞数量更少(图12)。
89.实施例3：相比未经处理的dnt细胞，经ven处理的dnt细胞诱导明显更大程度的肿瘤体积和肿瘤重量减少
90.接下来，采用异种移植模型在体内研究使用ven对扩增t细胞的离体处理是否能提高其疗效。免疫缺陷小鼠皮下接种人白血病细胞。肿瘤形成后(尺寸》100mm3)，给这些小鼠静脉输注单剂量的非药物处理或经ven处理的dnt细胞，并监测肿瘤生长情况。虽然如前所述，dnt细胞处理有效地靶向白血病(4
–
6)，但用vendnt细胞处理进一步减小肿瘤体积(第20日，dnt组为26.15％
±
5.724％，vendnt处理组为52.23％
±
8.468％；图3a)。同样，与用pbs或dnt细胞处理的小鼠相比，用vendnt细胞处理的小鼠的肿瘤重量显著降低(图3b)。这些数据表明，经ven处理的dnt细胞可以在体内更有效地靶向aml细胞。鉴于aml主要存在于骨髓(bm)中，接下来研究了vendnt细胞是否能更有效地靶向骨髓移植的aml。此前的报道显示kg1a在异种移植模型中对dnt细胞处理具有高度的耐药性(6)。尽管dnt细胞的作用很小，但与pbs和dnt细胞处理组相比，vendnt细胞处理组小鼠的kg1a移植水平显著下降，进一步支持了vendnt细胞即使针对以另外方式耐药的细胞亦能表现出优异的抗白血病活性(图3c)。
91.用经ven处理的dnt离体处理的原发性aml样本移植的量少于单独使用dnt处理的相同细胞的量(图3d)。进一步研究了经ven处理的dnt对原发性aml样本移植的影响。小鼠经静脉注射原发性aml细胞后，用dnt或经ven处理的dnt进行处理。与用媒介物对照或dnt处理的小鼠相比，用经ven处理的dnt处理小鼠减少了aml移植和计数(图3e和图13a)。在dnt组和经ven处理的dnt组中检测到t细胞频率相似(图13b)，这表明经ven处理的dnt具有更高的抗白血病活性，这得益于dnt在功能上的提升，而不是其在持续性或增殖能力上的提升。重要的是，从这些处理中没有观察到明显的毒性(图14)。
92.实施例4：ven增加常规t细胞的细胞毒性
93.虽然用ven处理dnt细胞以增强其抗白血病活性可能有利于dnt疗法，但由于临床上t
conv
细胞更为广泛地作为癌症免疫疗法使用，因此进行实验以确定ven是否对cd4

或cd8

常规t(t
conv
)细胞的抗白血病活性有作用。为此，在与aml细胞系共培养之前，用不同浓度的ven预处理多克隆活化的t
conv
细胞。与在dnt细胞中观察到的相似，观察到t
conv
细胞对各种aml细胞系的细胞毒性显著增强(图4)。这些数据表明，ven可以提高t
conv
和dnt细胞的抗白血病活性，并支持ven与过继t细胞疗法联合使用以进一步增强治疗效果。
94.实施例5：与其他bcl-2抑制剂相比，ven独特地增加了dnt细胞毒性
95.众所周知，bcl-2保护细胞免于凋亡，可以预期抑制该通路会导致t细胞凋亡加剧，并减弱t细胞功能。鉴于ven能增加t细胞介导的细胞毒性这一意外发现，接下来使用bcl-2家族蛋白泛抑制剂奥巴克拉以及bcl-2、bcl-xl和bcl-w抑制剂abt-737确定对其他抗细胞凋亡bcl-2家族蛋白的抑制是否会有类似的效果。与ven相反，这些bcl-2家族蛋白抑制剂诱导dnt细胞死亡或抑制其细胞毒性(图5a和图5b)。bcl-xl在dnt细胞上的表达水平相比其在
aml细胞上的表达水平相对更高(图5c)，这表明dnt细胞可以通过bcl-xl的补偿活性对bcl-2抑制产生抗性。
96.实施例6：ven处理增加dnt效应分子与活化标志物的表达和ros水平
97.为了阐明ven介导t细胞的增加的细胞毒性的潜在机制，比较了经ven处理或未经ven处理的dnt细胞上t细胞活化标志物和效应分子的表达。ven处理导致dnt细胞上活化标志物cd69和cd25(图6a)以及效应分子nkg2d和dnam-1的表达更高(图6b)。经ven处理的dnt细胞也比媒介物处理的细胞表达更高水平的颗粒酶b(图6c)。同样，在经ven处理的cd8

(图6d)t
conv
细胞上也观察到cd25、nkg2d和dnam-1表达的剂量依赖性增加。用维奈托克处理dnt和t
conv
细胞，最少4小时，最多3日，增加了t细胞对aml的细胞毒性(图4b)，同时增加了t细胞活化标志物(cd69和cd25；图6a)和活化受体(nkg2d和dnam-1；图6b)的表达，而没有改变t细胞的活力(图4c)。因此，维奈托克直接活化效应t细胞以增加其细胞毒性，而不消耗幼稚或抑制性t细胞亚群。
98.最近的研究报道，维奈托克增加ros水平，而ros在t细胞活化信号级联放大中起重要作用(9、13
–
15)。然而，之前未曾报道过ven是否增加t细胞中的ros水平以及增强t细胞活化。为了确定ros在维奈托克介导的t细胞活化和增强中的介入，测定了经浓度递增的维奈托克处理的dnt细胞和cd8 t
conv
细胞中细胞与线粒体ros的水平。维奈托克以剂量依赖性方式增加dnt和cd8 t
conv
细胞中的细胞ros(图7a)。尽管抗氧化剂nrf2的表达和核定位出现补偿性升高，但仍观察到ros水平增加(图7b)。
99.为了确定经维奈托克处理的dnt细胞中较高ros水平的功能相关性，我们用维奈托克和浓度递增的n-乙酰半胱氨酸(nac)共同处理dnt细胞。用维奈托克和nac处理降低了细胞ros水平，并消除了维奈托克对dnt细胞介导的抗aml细胞毒性的影响(图7c)，从而证明了维奈托克-dnt细胞中ros水平升高的功能相关性。如图7l所示，用维奈托克和浓度递增的ros清除剂n-乙酰半胱氨酸(nac)共同处理dnt消除了维奈托克诱导的ros生成并阻断了活化标志物的上调。
100.维奈托克增加了恶性肿瘤细胞中ros的生成(9、21)，并且ros在t细胞活化和分化中起着重要作用(15、22
–
24)。为了进一步了解维奈托克活化t细胞的机制，我们测量了经维奈托克处理的dnt和t
conv
细胞中的ros生成。维奈托克以与增加的t细胞效应功能相关的浓度和时间增加dnt和t
conv
细胞中细胞ros与线粒体ros(图7h
–
k)。
101.为了解ven增加dnt中的线粒体ros的机制，我们测量了呼吸链蛋白的水平。在电子传递链(etc)复合物i、ii和iv、亚基ndufa9、uqcrc2和mtco1中均未观察到变化。ros的生成受呼吸链超级复合物的调节，呼吸链超级复合物是含呼吸链复合物i、iii和iv的高级四级结构。呼吸链超级复合物的减少可能与线粒体ros的较高产生有关(16、17)。如通过非变性凝胶测量的，维奈托克减少了dnt细胞中呼吸链超级复合物的形成(图7d)。
102.为了确定其他ros诱导剂对dnt介导的细胞毒性的影响，用浓度递增的阿糖胞苷、柔红霉素和抗霉素对dnt进行了处理。在用阿糖胞苷和抗霉素处理的dnt中观察到ros水平以剂量依赖性方式增加，而活力没有或几乎没有损失(图15a和图15b)。经柔红霉素处理的dnt具有较低的ros水平，其活力也大幅下降(图15a和图15b)。与维奈托克处理不同，尽管细胞ros水平增加，但阿糖胞苷和抗霉素并没有增强dnt的细胞毒性，而柔红霉素降低了dnt介导的抗aml的细胞毒性(图15c)。这些数据表明，dnt介导的细胞毒性的ros依赖性增加是维
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