一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗。


背景技术：

2.冠状病毒是一种有囊膜的正义rna病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属。一些冠状病毒严重威胁人类健康，如导致严重呼吸综合征(sars)爆发的sars-cov和导致中东呼吸综合征(mers)爆发的mers-cov，以及导致新冠病毒肺炎(covid-19)的sars-cov-2。此外，还有一些在人体导致症状较轻疾病的冠状病毒，如hcov-nl63、hcov-229e、hcov-oc43和hcov-hku1等。一些冠状病毒还可以感染动物，对宠物健康和牲畜生产造成影响，如猫腹膜炎病毒(fipv)会导致猫的腹膜炎和腹水、具有高致死率，猪流行性腹泻病毒(pedv)会导致生猪腹泻、严重威胁生猪的生产。此外，还有可以感染犬、鼠和牛的冠状病毒。抵御病毒感染最有效的方式就是疫苗接种，目前世界各国都在加紧研发针对新型冠状病毒及其它冠状病毒的疫苗。
3.在新冠疫情爆发的初期，科学家已经证实该病毒进入细胞采用的受体为细胞表面的蛋白ace2，而直接介导与ace2相互作用的是病毒表面刺突蛋白(s)上的受体结合区(rbd)。从自然感染患者体内分离得到的中和抗体大多数能够结合rbd并且阻止rbd与ace2的相互作用，因此rbd作为免疫原将能够刺激机体产生中和抗体抑制病毒与受体的结合。
4.目前的研究显示，将rbd单体或者二聚体蛋白或者编码rbd的mrna作为疫苗均能够刺激机体产生中和抗体。但rbd单体或者二聚体的免疫原性相对较弱，且目前尚无被批准上市的rna疫苗，其长期的安全性仍然不明确，因此开发具较高安全性且高免疫原性的rbd亚单位疫苗十分必要。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗。
6.第一方面，本发明要求保护一种重组病毒样颗粒。
7.本发明要求保护的重组病毒样颗粒为携带有特异蛋白的基孔肯雅病毒样颗粒；所述特异蛋白为sars-cov-2的s蛋白或sars-cov-2s蛋白的rbd区段。由病毒样颗粒呈递所述特异蛋白。
8.基孔肯雅病毒样颗粒由基孔肯雅病毒的capsid蛋白、e1蛋白、e2蛋白、e3蛋白和6k蛋白自组装形成。基孔肯雅病毒的capsid蛋白、e1蛋白、e2蛋白、e3蛋白、6k蛋白由基孔肯雅病毒多聚蛋白capsid-e3-e2-6k-e1(见图1)被宿主蛋白酶切割产生。
9.进一步地，所述重组病毒样颗粒由基孔肯雅病毒的capsid蛋白、基孔肯雅病毒的e1蛋白、融合蛋白a和基孔肯雅病毒的6k蛋白自组装形成。上述各蛋白是由多聚蛋白“capsid-融合蛋白a-6k-e1”被宿主蛋白酶切割产生。所述融合蛋白a含有基孔肯雅病毒的e2蛋白、e3蛋白和所述特异蛋白。
10.其中，所述特异蛋白替换基孔肯雅病毒e3蛋白与e2蛋白之间的furin酶切位点。发明人尝试了一些附近其他位置，但这些尝试未能检测到vlp的形成。
11.进一步地，所述融合蛋白a中还可含有用于纯化的标签蛋白，如flag标签。
12.更进一步地，所述融合蛋白a自n端到c端依次包括基孔肯雅病毒的e3蛋白、所述特异蛋白、基孔肯雅病毒的e2蛋白的n端区段、flag标签和基孔肯雅病毒的e2蛋白的c端区段。
13.其中，所述flag标签插入到基孔肯雅病毒的e2蛋白的第204位和第205位氨基酸之间。
14.更加具体地，所述融合蛋白a自n端到c端依次由基孔肯雅病毒的e3蛋白、柔性肽1、所述特异蛋白、柔性肽2、基孔肯雅病毒的e2蛋白的n端区段、柔性肽3、flag标签、柔性肽4和基孔肯雅病毒的e2蛋白的c端区段组成。
15.其中，用于连接功能蛋白或蛋白功能区的四个柔性肽可根据实际情况设置，包括：若某一个或多个柔性肽前后的功能蛋白或蛋白功能区直接相连不会影响相关蛋白的功能，则可以省去相应柔性肽而采用直接连接法。当然，也可以采用多种柔性肽，如gsgg、gggs、sgs、sssg、ggggs、(ggggs)n等，只要不影响相关蛋白的功能即可。
16.第二方面，本发明要求保护如下任一生物材料：
17.p1、融合蛋白b，自n端到c端依次由基孔肯雅病毒的capsid蛋白、基孔肯雅病毒的e1蛋白、前文第一方面中所述融合蛋白a和基孔肯雅病毒的6k蛋白组成。
18.p2、编码p1中所述融合蛋白b的核酸分子。
19.p3、含有p2中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
20.所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述融合蛋白b的dna，该dna不但可包括启动所述融合蛋白b的编码基因转录的启动子，还可包括终止所述融合蛋白b的编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
21.进一步地，p3中所述重组载体可为含有所述核酸分子的真核表达载体。
22.更进一步地，所述重组载体为将所述核酸分子克隆到pcdna3.1( )载体后得到的重组质粒。
23.在本发明的具体实施方式中，所述重组载体具体为将所述核酸分子取代pcdna3.1( )载体的kpni和xhoi之间的小片段后得到的重组质粒。
24.第三方面，本发明要求保护前文第一方面中所述重组病毒样颗粒的制备方法。
25.本发明要求保护的前文第一方面中所述重组病毒样颗粒的制备方法，可包括如下步骤：将前文第二方面中所述的重组载体导入哺乳动物细胞，然后进行细胞培养，进而获得所述重组病毒样颗粒。
26.在本发明的具体实施方式中，所述哺乳动物细胞为hek293f细胞。
27.在所述方法中，具体是采用smm293-tii培养基培养hek293f细胞至对数生长期，然后转染所述重组载体；转染后继续培养24h，然后加入无血清无蛋白补料液的sms 293-supi继续培养48h；然后从细胞培养上清液中获得所述重组病毒样颗粒的。
28.进一步地，可按照如下从细胞培养上清液中获得所述重组病毒样颗粒：向所述细胞培养上清液中加入anti-flag琼脂糖珠，4℃震荡混匀12h；离心收集琼脂糖珠，转移至重
力流空柱，洗去杂蛋白后用含200μg/ml 3
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flag peptide的缓冲液竞争性洗脱目的蛋白(而后还可通过100kd cutoff浓缩管浓缩)，得到chikv-rbd-flag2-vlp溶液(即含有所述重组病毒样颗粒的溶液)。
29.第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
30.q1、前文第二方面所述生物材料在制备前文第一方面所述重组病毒样颗粒中的应用；
31.q2、前文第一方面所述的重组病毒样颗粒或前文第二方面所述生物材料在制备用于预防sars-cov-2感染所致疾病的产品(如疫苗或药物)中的应用。
32.第五方面，本发明要求保护一种用于预防sars-cov-2感染所致疾病的疫苗。
33.本发明要求保护的用于预防sars-cov-2感染所致疾病的疫苗，其活性成分为前文第一方面所述的重组病毒样颗粒。
34.进一步地，所述疫苗中还含有佐剂，如铝佐剂。
35.更进一步地，所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂。
36.在本发明的具体实施方式中，所述佐剂具体为imject alum(thermo scientific corp，货号为77161)。相应的，所述疫苗由所述重组病毒样颗粒和imject alum按照2μg(按照蛋白含量计)：50μl的比例混合而成。
37.在第四方面和第五方面中，所述sars-cov-2感染所致疾病均具体可为新冠病毒肺炎(covid-19)。
38.在上述各方面中，所述sars-cov-2s蛋白的rbd区段的氨基酸序列可如seq id no.5的第325-518位所示；或者，来源于sars-cov-2且与seq id no.5的第325-518位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.5的第325-518位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
39.在上述各方面中，所述基孔肯雅病毒的capsid蛋白的氨基酸序列可如seq id no.5的第1-261位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.5的第1-261位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.5的第1-261位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
40.在上述各方面中，所述基孔肯雅病毒的e1蛋白的氨基酸序列可如seq id no.5的第1022-1460位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.5的第1022-1460位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.5的第1022-1460位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
41.在上述各方面中，所述基孔肯雅病毒的6k蛋白的氨基酸序列可如seq id no.5的第960-1021位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.5的第960-1021位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.5的第960-1021位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
42.在上述各方面中，所述基孔肯雅病毒的e3蛋白的氨基酸序列可如seq id no.5的
第262-321位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.5的第262-321位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.5的第262-321位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
43.在上述各方面中，所述基孔肯雅病毒的e2蛋白的氨基酸序列可如seq id no.4的第326-747位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.4的第326-747位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.4的第326-747位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
44.在上述各方面中，所述flag标签的氨基酸序列可如seq id no.5的第730-737位所示。
45.在上述各方面中，所述基孔肯雅病毒的e2蛋白的n端区段的氨基酸序列可如seq id no.5的第523-725位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.5的第523-725位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.5的第523-725位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
46.在上述各方面中，所述基孔肯雅病毒的e2蛋白的c端区段的氨基酸序列可如seq id no.5的第742-959位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与seq id no.5的第742-959位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.5的第742-959位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
47.在上述各方面中，所述柔性肽1的氨基酸序列可如seq id no.5的第322-324位所示。
48.在上述各方面中，所述柔性肽2的氨基酸序列可如seq id no.5的第519-522位所示。
49.在上述各方面中，所述柔性肽3的氨基酸序列可如seq id no.5的第726-729位所示。
50.在上述各方面中，所述柔性肽4的氨基酸序列可如seq id no.5的第738-741位所示。
51.进一步地，所述融合蛋白a的氨基酸序列可如seq id no.5的第262-959位所示；或者与seq id no.5的第262-959位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.5的第262-959位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
52.更进一步地，前文所述融合蛋白b的氨基酸序列可如seq id no.5所示全部序列；或者与seq id no.5所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将seq id no.5所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
53.在上述各方面中，在前文p2所述核酸分子中，编码所述基孔肯雅病毒的capsid蛋白的核酸分子可如seq id no.2的第1-783位所示；或者与seq id no.2的第1-783位具有
98％以上同一性且编码所述基孔肯雅病毒的capsid蛋白的dna分子。
54.在上述各方面中，在前文p2所述核酸分子中，编码所述基孔肯雅病毒的e1蛋白的核酸分子可如seq id no.2的第3064-4383位所示；或者与seq id no.2的第3064-4383位具有98％以上同一性且编码所述基孔肯雅病毒的e1蛋白的dna分子。
55.在上述各方面中，在前文p2所述核酸分子中，编码所述融合蛋白a的核酸分子可如seq id no.2的第784-2877位所示；或者与seq id no.2的第784-2877位具有98％以上同一性且编码所述融合蛋白a的dna分子。
56.在上述各方面中，在前文p2所述核酸分子中，编码所述基孔肯雅病毒的6k蛋白的核酸分子可如seq id no.2的第2878-3063位所示；或者与seq id no.2的第2878-3063位具有98％以上同一性且编码所述基孔肯雅病毒的6k蛋白的dna分子。
57.进一步地，前文p2中所述核酸分子可如seq id no.2全部序列所示；或者与seq id no.2具有98％以上同一性且编码所述融合蛋白b的dna分子。
58.本发明提供了具有冠状病毒受体结合区的基孔肯雅病毒样颗粒(chikv-vlp)，可作为预防新型冠状病毒(sars-cov-2)感染所致疾病的亚单位疫苗。本发明通过瞬时转染重组质粒在293f细胞中表达chikv-rbd-flag2融合蛋白。chikv-rbd-flag2融合蛋白中基孔肯雅病毒e2蛋白第204位和第205位氨基酸之间插入flag标签(序列：dykddddk)，同时chikv-rbd-flag2融合蛋白中基孔肯雅病毒e3蛋白与e2蛋白之间的furin酶切位点(序列rqrr)被sars-cov-2rbd(含t333-g526)肽段替换，并在rbd的上、下游分别添加了3个和4个柔性氨基酸，在flag标签的上、下游各添加了4个柔性氨基酸(gsggdykddddkgggs)，chikv-rbd-flag2融合蛋白在细胞中翻译表达后形成capsid-e3-rbd-e2-dykddddk(flag标签)-e2-6k-e1多聚蛋白，该多聚蛋白自切割成capsid，e3-rbd-e2-dykddddk(flag标签)-e2，6k，以及e1蛋白，并由这些蛋白自组装形成不规则球形的病毒样颗粒，即chikv-rbd-flag2-vlp。chikv-rbd-flag2-vlp的表面高密度展示sars-cov-2rbd以刺激免疫细胞产生针对rbd的免疫反应及抗体。对balb/c小鼠进行免疫，发现chikv-rbd-flag2-vlp能够高效刺激小鼠产生针对sars-cov-2rbd的抗体，并能够诱导产生高滴度的中和抗体。
附图说明
59.图1为chikv多聚蛋白和chikv-rbd-flag2融合蛋白的结构示意图。
60.图2为chikv-rbd-flag2-vlp的电镜负染照片。
61.图3为sars-cov-2rbd的分子筛纯化的色谱图。
62.图4为检测血清中sars-cov-2rbd特异性的igg抗体滴度的结果。
63.图5为检测血清中中和抗体的滴度的结果。图中，ec50的单位是血清稀释倍数。
具体实施方式
64.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
65.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊
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106个细胞/ml培养体系)，然后借助pei max(polysciences,24765-2)转染重组质粒pcdna3.1-chikv-vlp(2μg重组质粒/ml培养体系)，然后继续培养24h，然后加入无血清无蛋白补料液sms 293-supi(35ml/l培养体系)，然后继续培养48h。smm 293-tii培养基和无血清无蛋白补料液sms 293-supi(又称为sms 293-supi培养基添加液)均为义翘神州生物技术有限公司产品。
81.2、完成步骤1后，1000g离心10min，收集上清。
82.3、取步骤2得到的上清，4500g离心1h，收集上清。
83.4、取步骤3得到的上清，加入peg6000(使其在体系中的浓度为7g/100ml)和nacl(使其在体系中的浓度为0.5m)，4℃搅拌12小时，然后4500g离心1h，收集沉淀。
84.5、取步骤4得到的沉淀，先用缓冲液小心清洗，然后用缓冲液重悬，得到沉淀重悬液。蔗糖作为溶质，缓冲液作为溶剂，使蔗糖浓度为24g/100ml，即24％蔗糖溶液。向beckman sw41ti转子对应的超速离心管中加入2ml 24％蔗糖溶液，然后将约7.5ml沉淀重悬液小心铺在蔗糖溶液上方，然后使用超速离心机4℃、32000rpm离心2h，收集离心管底的沉淀。
85.6、取步骤5得到的沉淀，用缓冲液重悬，得到沉淀悬液。在beckman sw41ti转子对应的透明超速离心管中制备20％-60％连续密度梯度蔗糖(蔗糖作为溶质，缓冲液作为溶剂，蔗糖浓度％含义为g/100ml)，然后将1ml沉淀悬液铺于连续密度梯度蔗糖的顶部，使用超速离心机4℃、140000g离心15h，穿刺抽取密度梯度中上部的目的条带。
86.7、取步骤6得到的抽取物，采用型号为100kd cutoff的浓缩管将缓冲体系置换为缓冲液，即为chikv-vlp溶液。
87.8、取步骤7得到的溶液，采用nanodrop检测蛋白浓度，分装后液氮速冻存于-80℃。
88.三、制备chikv-rbd-flag2-vlp
89.1、采用smm 293-tii培养基培养hek293f细胞至对数生长期(密度达到1.5
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106个细胞/ml培养体系)，然后借助pei max(polysciences,24765-2)转染重组质粒pcdna3.1-chikv-rbd-flag2(2μg重组质粒/ml培养体系)，然后继续培养24h，然后加入无血清无蛋白补料液sms 293-supi(35ml/l培养体系)，然后继续培养48h。smm 293-tii培养基和无血清无蛋白补料液sms 293-supi(又称为sms 293-supi培养基添加液)均为义翘神州生物技术有限公司产品。
90.2、完成步骤1后，1000g离心10min，收集上清。
91.3、取步骤2得到的上清，4500g离心1h，收集上清。
92.4、取步骤3得到的上清，加入anti-flag beads(每升上清约配比1ml beads)，4℃震荡混匀12小时。anti-flag beads：金斯瑞生物科技有限公司。
93.5、完成步骤4后，100g离心10min，收集beads。
94.6、将步骤5收集的beads转移到重力流空柱(bio-rad公司，型号为econo-pac)中，使用缓冲液充分洗去杂蛋白，然后使用含200μg/ml 3
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flag peptide的缓冲液竞争性洗脱目的蛋白，而后通过100kd cutoff浓缩管浓缩并置换为缓冲液，得到chikv-rbd-flag2-vlp溶液。3
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flag peptide：强耀生物。
95.7、取步骤6得到的溶液，采用nanodrop检测蛋白浓度，分装后液氮速冻存于-80℃。
96.8、取步骤6得到的chikv-rbd-flag2-vlp溶液，进行电镜观察。chikv-rbd-flag2-vlp的电镜复染照片见图2。呈现不规则的球形。
97.实施例2、免疫效果评价
98.铝胶佐剂(imject alum，为氢氧化铝佐剂)：thermo scientific corp，货号为77161。
99.采用实施例1制备的chikv-vlp溶液或chikv-rbd-flag2-vlp溶液，用ph7.4的pbs缓冲液调整蛋白浓度。
100.一、分组免疫
101.4-6周龄balb/c雌鼠随机分为三组，每组3只。免疫过程：试验第1天进行初次免疫，试验第15天进行加强免疫。免疫方式均为：右后肢肌肉注射。单次单只小鼠免疫100μl免疫物。chikv-vlp组：每100μl免疫物由50μl chikv-vlp溶液(蛋白含量为2μg)和50μl铝胶佐剂乳化得到。chikv-rbd-flag2-vlp组：每100μl免疫物由50μl chikv-rbd-flag2-vlp溶液(蛋白含量为2μg)和50μl铝胶佐剂乳化得到。pbs对照组：免疫物为pbs缓冲液。
102.分别于初次免疫后第21天、第35天、第56天，下颌采血。取血样，4℃静置约1h，然后1500g离心15min，收集血清。
103.二、检测血清中sars-cov-2rbd特异性的igg抗体滴度。
104.取初次免疫后第21天的血清和初次免疫后第35天的血清，采用elisa检测特异性结合sars-cov-2rbd的igg抗体滴度。
105.1、制备sars-cov-2rbd
106.(1)将seq id no.3所示的dna分子(为经过密码子优化的sars-cov-2rbd(319r-541f)-strep-flag序列，编码seq id no.6所示氨基酸序列)插入pcdna3.1( )质粒的nhei和bamhi酶切位点之间，得到重组质粒，经测序验证正确后命名为重组质粒pcdna3.1-rbd-flag。
107.(2)采用smm 293-tii培养基培养hek293f细胞至对数生长期(密度达到1.5
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106个细胞/ml培养体系)，然后借助pei max(polysciences,24765-2)转染重组质粒pcdna3.1-rbd-flag(2μg重组质粒/ml培养体系)，继续培养24h，然后加入无血清无蛋白补料液sms 293-supi(35ml/l培养体系)，继续培养48h。smm 293-tii培养基和无血清无蛋白补料液sms 293-supi(又称为sms 293-supi培养基添加液)均为义翘神州生物技术有限公司产品。
108.(3)完成步骤1后，1000g离心10min，收集上清。
109.(4)取步骤(3)得到的上清，4500g离心1h，收集上清，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。
110.(5)取步骤(4)得到的滤液，采用anti-flag beads亲和层析进行纯化。
111.具体参数：在重力流空柱(bio-rad公司，型号为econo-pac)中填充anti-flag beads(金斯瑞生物科技有限公司)，每升滤液约配比1ml beads，在上述重力流空柱中使上述滤液流穿beads 3遍，然后用缓冲液充分洗去杂蛋白，然后用含200μg/ml 3
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flag peptide(强耀生物)的缓冲液竞争性洗脱目的蛋白，而后通过10kd cutoff浓缩管浓缩。
112.(6)取步骤(5)得到的溶液，通过分子筛进行纯化。
113.具体参数：使用ge凝胶过滤预装柱superdex 200increase 10/300gl(分子筛)；上样体积0.2ml，使用25ml缓冲液洗脱，色谱图显示2个峰(峰值对应的保留体积分别为13.3ml和14.9ml)(见图3)，这两个峰分别对应sars-cov-2rbd的二聚体和单体(使用的预装柱
13.3ml对应分子量约65kda，14.9ml对应分子量约32kda。而rbd-flag蛋白分子量为30.7kda。根据分子量大小两个峰分别为二聚体和单体)，收集单体峰(保留体积14.9ml的为单体峰)，即为sars-cov-2rbd溶液。
114.2、检测血清中sars-cov-2rbd特异性的igg抗体滴度
115.(1)包被：取酶标板，每孔加入100μl步骤1制备的sars-cov-2rbd溶液(sars-cov-2rbd的包被量为100ng/孔，用缓冲液调整蛋白浓度)，4℃孵育过夜，弃上清。
116.(2)b3t封闭，37℃孵育1小时，弃上清。
117.(3)每孔加入100μl血清稀释液，37℃孵育1小时。弃上清，pbst洗涤。
118.(血清稀释液：取步骤一得到的血清，用b3t梯度稀释。每个稀释度设置至少2个复孔。)
119.(4)加入b3t稀释的酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育1小时，然后弃上清，pbst洗涤。
120.(酶标二抗为抗小鼠igg(工作浓度为1:4000)。抗小鼠igg：abcam公司，货号ab6789。)
121.(5)每孔加入100μl tmb染液室温孵育。
122.(6)每孔加入50μl终止液。
123.(7)用酶标仪读取450nm处的吸光值。
124.pbs(1l配方，ph7.4)：磷酸二氢钾(kh2po4)0.27g，磷酸氢二钠(na2hpo4)1.42g，氯化钠(nacl)8g，氯化钾(kcl)0.2g，加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.4，最后定容到1l。
125.pbst：1lpbs添加0.5ml的twenn-20。
126.b3t：含有3％(3g/100ml)bsa的pbst。
127.结果见图4。chikv-rbd-flag2-vlp刺激小鼠产生了高滴度的结合sars-cov-2rbd的抗体。
128.三、检测血清中中和抗体的滴度
129.取chikv-rbd-flag2-vlp组动物初次免疫后第35天的血清和初次免疫后第56天的血清，使用sars-cov-2surrogate virus neutralization test kit(genscript,cat.no.:l00847)检测血清的中和抗体滴度，具体方法参照试剂盒说明书。
130.结果见图5。可见chikv-rbd-flag2刺激小鼠产生了高滴度的中和抗体。
131.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。